Diferența dintre secvențierea Sanger și Pyrosequencing

Diferența cheie - Sequencing Sanger vs Pyrosequencing
 

Secvențierea ADN-ului este foarte importantă pentru analiza ADN-ului, deoarece cunoașterea aranjamentului corect al nucleotidelor pe o anumită regiune a ADN-ului relevă multe informații importante despre acesta. Există diferite metode de secvențiere a ADN-ului. Secventierea Sanger și Pyrosequencing sunt două metode diferite de secvențiere a ADN utilizate pe scară largă în Biologie Moleculară. Diferența cheie între secvențierea lui Sanger și Pyrosequencing este aceea Secvențierea lui Sanger utilizează dideoxinucleotide pentru a termina sinteza ADN-ului pentru a citi secvența de nucleotide în timp ce piroservenția detectează eliberarea pirofosfatului prin încorporarea nucleotidelor și sintetizând secvența complementară pentru a citi ordinea exactă a secvenței.

CUPRINS
1. Prezentare generală și diferență cheie
2. Ce este Sanger Sequencing
3. Ce este Pyrosequencing
4. Comparație între ele - Sanger Sequencing vs. Pyrosequencing
5. rezumat

Ce este Sanger Sequencing?

Serializarea Sanger este o metodă de secvențiere a primei generații a ADN dezvoltată de Frederick Sanger și colegiile sale în 1977. Este, de asemenea, cunoscută ca Repartizarea lanțului de terminare sau Secvențierea dideoxi deoarece se bazează pe terminarea lanțului de către dideoxinucleotide (ddNTPs). Această metodă a fost folosită pe scară largă pentru mai mult de 30 de ani până la dezvoltarea secvenței de generație nouă (NGS). Tehnica de secvențiere a lui Sanger a permis descoperirea ordinii nucleotidice corecte sau atașarea unui fragment ADN special. Se bazează pe încorporarea selectivă a ddNTP și terminarea sintezei ADN în timpul testului in vitro Replicare ADN. Absența grupărilor 3 'OH pentru a continua formarea legăturii fosfodiestere între nucleotidele adiacente este o caracteristică unică a ddNTPs. Prin urmare, odată ce ddNTP este atașat, alungirea lanțurilor încetează și se termină din acest punct. Există patru ddNTP - ddATP, ddCTP, ddGTP și ddTTP - utilizate în secvențierea lui Sanger. Aceste nucleotide opresc procesul de replicare a ADN-ului atunci când sunt încorporate în lanțul de creștere a ADN-ului și au ca rezultat lungimi diferite de ADN scurt. Capsulele de electroforeză se utilizează pentru a organiza aceste catene scurte de ADN prin dimensiunile lor pe un gel, așa cum se arată în Figura 01.

Figura 1: Electroforeza gelului capilar cu ADN scurt sintetizat

Pentru in vitro replicarea ADN-ului, ar trebui prevăzute puține cerințe. Acestea sunt enzimă ADN polimerază, ADN șablon, primeri oligonucleotidici și deoxinucleotide (dNTPs). În secvențierea lui Sanger, replicarea ADN se efectuează în patru tuburi separate, împreună cu patru tipuri de ddNTP separat. Deoxinucleotidele nu sunt în totalitate înlocuite cu ddNTP-urile respective. Un amestec de dNTP special (de exemplu, dATP + ddATP) este inclus în tub și reprodus. Patru produse din tuburi separate sunt executate pe gel într-patru puțuri separate. Apoi, prin citirea gelului, secvența poate fi construită așa cum se arată în Figura 02.

Figura 02: Secvențierea lui Sanger

Serializarea Sanger este o tehnică importantă care ajută în multe domenii ale biologiei moleculare. Proiectul genomului uman a fost finalizat cu succes cu ajutorul metodelor bazate pe secvențierea lui Sanger. Secvențierea lui Sanger este, de asemenea, utilă în secvențarea țintă a ADN-ului, cercetarea cancerului și a bolilor genetice, analiza expresiei genei, identificarea umană, detecția patogenului, secvențierea microbiană etc..

Există câteva dezavantaje ale secvențierii lui Sanger:

• Lungimea ADN-ului care este secvențiată nu poate depăși 1000 de perechi de baze
• Numai o catenă poate fi secvențiată la un moment dat.
• Procesul este consumator de timp și costisitor.

Prin urmare, s-au dezvoltat noi tehnici avansate de secvențiere cu timpul pentru a depăși aceste probleme. Totuși, secvențializarea lui Sanger este încă utilizată datorită rezultatelor sale foarte precise, până la aproximativ 850 de fragmente de lungime de pereche de bază.

Ce este Pyrosequencing?

Pyrosequencingul este o tehnică nouă de secvențiere a ADN bazată pe "secvențierea prin sinteză". Această tehnică se bazează pe detectarea eliberării pirofosfatului la încorporarea nucleotidelor. Procesul este utilizat de patru enzime diferite: polimer ADN, sulfurilază ATP, luciferază și apirază și două substraturi fosfosulfat de 5 'adenozină (APS) și luciferină.

Procesul începe cu legarea primerului cu șablonul ADN monocatenar, iar ADN polimeraza începe încorporarea nucleotidelor complementare acestuia. Când nucleotidele se unesc împreună (polimerizarea acidului nucleic), aceasta eliberează grupurile și energia pirofosfat (două grupuri de fosfat legate între ele). Fiecare adăugare de nucleotide eliberează cantitatea echimolară de pirofosfat. Pirofosfatul se transformă în ATP prin sulfurilază ATP în prezența substratului APS. ATP generat conduce conversia mediată de luciferază a luciferinei în oxicluferină, producând lumină vizibilă în cantități proporționale cu cantitatea de ATP. Lumina este detectată de un dispozitiv de detectare a fotonilor sau de fotomultiplicator și creează o pirogramă. Apyrase degradează ATP și dNTP neincluse în amestecul de reacție. adăugarea dNTP se face o dată la un moment dat. Deoarece adăugarea de nucleotide este cunoscută în funcție de încorporarea și detectarea luminii, secvența șablonului poate fi determinată. Pyrograma este utilizată pentru generarea secvenței de nucleotide a probei ADN așa cum se arată în Figura 03.

Pyrosequencingul este foarte important în analiza polimorfismului cu un singur nucleotid și în secvențarea scurtelor secvențe de ADN. Precizia, flexibilitatea, ușurința automatizării și procesarea paralelă sunt avantajele piroservenței asupra tehnicilor de secvențiere Sanger.

Figura 03: Pyrosequencing

Care este diferența dintre secvența Sanger și Pyrosequencing?

Sanger Sequencing vs. Pyrosequencing
Secvențierea lui Sanger este o metodă de secvențiere a ADN bazată pe încorporarea selectivă a ddNTPs prin ADN polimerază și terminarea lanțului.	Pyrosequencingul este o metodă de secvențiere a ADN bazată pe detectarea eliberării pirofosfatului la încorporarea nucleotidei.
Utilizarea ddNTP
ddNTPs sunt utilizate pentru a termina replicarea ADN	ddNTPs nu sunt utilizate.
Enzime implicate
ADN polimeraza.	Se folosesc patru enzime: ADN polimeraza, ATP sulfurilaza, Luciferaza si Apyrase.
Substraturile folosite
APS și Luciferin nu sunt utilizate.	Se utilizează 5 'fosfosulfat de sodiu (APS) și luciferină.
Temperatura maximă
Acesta este un proces lent.	Acesta este un proces rapid.

Rezumat - Sanger Sequencing vs. Pyrosequencing

Sequencingul Sanger și Pyrosequencing sunt două metode de secvențiere ADN utilizate în biologia moleculară. Secvențierea lui Sanger construiește ordinea nucleotidelor în secvență prin terminarea alungirii lanțului în timp ce piroservenția construiește ordinea exactă a nucleotidelor în secvență prin încorporarea nucleotidelor și detectarea eliberării pirofosfatilor. Prin urmare, diferența principală dintre secvențierea lui Sanger și Pyrosequencing este că secvențializarea lui Sanger funcționează pe secvențierea prin terminarea lanțului în timp ce operațiile de piroservenție lucrează la secvențierea prin sinteză.

Referinţă:
1. Fakruddin, Md și Abhijit Chowdhury. "Pyrosequencing-o alternativa la secventierea traditionala Sanger" Jurnalul American de Biochimie si Biotehnologie. Publicații Științifice, 02 Mar. 2012. Web. 28 februarie 2017.
2. "Secvențierea lui Sanger". Secvențierea lui Sanger - Subiecte ScienceDirect. N.p., n.d. Web. 28 februarie 2017

Datorită fotografiei:
1. "Dideoxy-Metoda" de Christoph Goemans (modificat) - Dr. Norman Mauder, pe baza datelor date de Christoph Goemans (CC BY-SA 3.0) prin intermediul Commons Wikimedia
2. "Sanger-DNA-seq" De Enzo la limba poloneză Wikipedia (CC BY-SA 3.0) prin intermediul Commons Wikimedia
3. "Pyrosequencing" prin microbiologie (CC BY-SA 2.0) prin intermediul Flickr