Diferența dintre blocajele nordice sudice și cele occidentale

Diferența cheie - Northern vs Southern vs Western Blotting
 

Detectarea secvențelor specifice de ADN, ARN și proteine ​​este esențială pentru diferite tipuri de studii în biologia moleculară. Gel electrophoresis este o tehnică care separă ADN, ARN, și proteine ​​în funcție de dimensiunile lor. Din profilurile de gel, secvența ADN specială, secvența ARN sau proteina sunt detectate prin tehnici speciale numite blotting și hibridizare cu sonde marcate. Există trei tipuri diferite de metode de blotting: sudul, nordul și vestul. Diferența esențială dintre blocajele nordice din sud și vest se află la tipul moleculei pe care o detectează dintr-un eșantion. Southern blotting este o metodă care detectează o secvență ADN specifică dintr-o probă de ADN. Blotarea Northern este o tehnică care detectează o secvență ARN specifică dintr-o mostră de ARN. Western blotting este o metodă care detectează o proteină specifică dintr-o probă de proteine.

CUPRINS
1. Prezentare generală și diferență cheie
2. Ce este Southern Blotting
3. Ce este Northern Blotting
4. Ce este Western Blotting
5. Comparație comparativă - Northern vs. Southern vs Western Blotting
6. rezumat

Ce este Southern Blotting?

Tehnica Southern blotting a fost dezvoltată de E.M. Southern în 1975 pentru identificarea unei secvențe ADN specifice dintr-o probă de ADN. Aceasta este prima tehnică de blot introdusă în biologia moleculară. Aceasta a permis detectarea unor gene specifice din ADN, fragmente specifice din ADN etc. Există mai multe etape implicate în tehnica Southern blotting. Ele sunt după cum urmează.

1. ADN-ul este izolat din probă și digerat cu endonucleaze de restricție.
2. Extractul digerat este separat prin electroforeză pe gel de agaroză.
3. Fragmentele ADN din gel sunt denaturate în filaje unice prin utilizarea unei soluții alcaline.
4. ADN-ul monocatenar este transferat pe o membrană de filtrare a nitrocelulozei prin transfer capilar.
5. ADN-ul transferat este fixat permanent pe membrană.
6. ADN-ul fixat pe membrană este hibridizat cu sonde marcate.
7. ADN nelegat este spălat din membrană prin spălare.
8. Filmul cu raze X este expus membranei și este pregătit un autoradiograf.

Southern blotting este aplicat pentru diferite aspecte ale biologiei moleculare. Este utilă în cartografierea RFLP, studii medico-legale, metilarea ADN-ului în expresia genelor, detectarea genelor mutante în tulburările genetice, amprentarea ADN-ului etc..

Figura 01: Tehnica Southern Blotting

Ce este Northern Blotting?

Blotarea Northern este o metodă concepută pentru a detecta o secvență ARN specifică sau o secvență mRNA dintr-o probă pentru a studia expresia genei. Această tehnică a fost dezvoltată de Alwine, Kemp și Stark în 1979. Aceasta diferă de tehnicile americane și western blotting datorită mai multor pași. Cu toate acestea, această tehnică este de asemenea efectuată prin electroforeză în gel, blotting și hibridizare cu sonde specificate marcate și detectare. Tehnica Northern blotting se realizează după cum urmează.

1. ARN se extrage din probă și se separă prin electroforeză pe gel.
2. ARN este transferat din gel pe o membrană blotting și fixat.
3. Membrana este tratată cu o probă marcată preparată din ADNc sau ARN (sonda este complementară la o secvență specifică din probă).
4. Sonda este incubată cu membrana pentru a se lega cu o secvență specifică.
5. Sondele neconsolidate sunt spălate.
6. Fragmentele hibridizate sunt detectate de un autoradiograf.

Blotarea Northern este un instrument important în detectarea și cuantificarea mRNA hibridizat, studierea degradării ARN-ului, evaluarea timpului de înjumătățire al ARN-ului, detectarea splicerii ARN-ului, studierea expresiei genei etc..

Figura 02: Northern Blotting

Ce este Western Blotting?

Western blotting este o metodă de detectare a unei proteine ​​specifice dintr-un amestec de proteine ​​prin utilizarea anticorpului marcat. Prin urmare, western blot este, de asemenea, cunoscut ca un imunoblotare. Această tehnică a fost introdusă de Towbin et al în 1979 și se efectuează în mod obișnuit în laboratoarele de analiză a proteinelor. Pașii sunt după cum urmează.

1. Proteinele sunt extrase din eșantion
2. Proteinele sunt separate prin dimensiunile lor utilizând electroforeza pe gel de poliacrilamidă
3. Moleculele separate sunt transferate într-o membrană PVDF sau în membrană de nitroceluloză prin electroporare
4. Membrana este blocată pentru legarea nespecifică a anticorpilor
5. Proteinele transferate sunt legate cu anticorp primar (anticorpi marcați cu enzime).
6. Membrana este spălată pentru a elimina anticorpii primari legați nespecific
7. Anticorpii legați sunt detectați prin adăugarea unui substrat și detectarea precipitatului colorat format

Western blotting este utilă pentru detectarea anticorpilor anti-HIV într-o probă de ser uman. De asemenea, testul Western blot poate fi folosit ca test de confirmare a infecției cu virusul hepatitei B și testul definitiv pentru boala vacii nebune.

Figura 03: Western Blotting

Care este diferența dintre Northern Southern și Western Blotting?

Northern vs. Southern vs Western blot
Tipul de moleculă detectat
Blotarea de la nord	Blotul Northern detectează o secvență ARN specifică dintr-o probă de ARN.
Blocarea sudică	Blocarea Southern detectează o secvență ADN specifică dintr-o probă de ADN.
Western blotting	Western blot detectează o proteină specifică dintr-o probă de proteine.
Tip de gel
Blotarea de la nord	Acest lucru utilizează gel de agaroză / formaldehidă.
Blocarea sudică	Aceasta folosește un gel de agaroză.
Western blotting	Acest lucru utilizează gel de poliacrilamidă.
Metoda de blotare
Blotarea de la nord	Acesta este un transfer capilar.
Blocarea sudică	Acesta este un transfer capilar.
Western blotting	Acesta este un transfer electric.
Probele folosite
Blotarea de la nord	cADN sau probe ARN marcate radioactiv sau non-radioactiv.
Blocarea sudică	Sondele ADN sunt etichetate radioactiv sau non-radioactiv.
Western blotting	Anticorpi primari sunt utilizați ca probe.
Sistemul de detectare
Blotarea de la nord	Acest lucru se face folosind un autoradiograf, sau detectarea de lumina sau schimbarea de culoare.
Blocarea sudică	Acest lucru se realizează utilizând un autoradiograf, detectarea modificării culorii sau a luminii.
Western blotting	Acest lucru se face folosind detectarea modificării culorii sau a luminii.

Rezumat - Northern vs. Southern vs Western blotting

Blotarea este o tehnică specială dezvoltată pentru identificarea ADN-ului, ARN-ului sau proteinei specifice din probele. Există trei proceduri separate de ștergere, și anume nordul, sudul și vestul, pentru a detecta un tip specific de moleculă. Tehnica Northern blotting este concepută pentru a detecta o secvență ARN specifică dintr-un amestec de ARN. Tehnica Southern blot permite detectarea unei secvențe ADN specifice dintr-o probă ADN și tehnica western blotting este dezvoltată pentru a identifica o proteină specifică dintr-un amestec de proteine.

Referințe
1. Gibbons, Janay. "Western Blot: Privire de ansamblu asupra proteinei transmise". Jurnalul nord-american al științelor medicale. Medknow Publications & Media Pvt Ltd, Mar. 2014. Web. 27 martie 2017
2. Brown, T. "Southern blotting" Protocoale curente în imunologie. Biblioteca Națională de Medicină din S.U.A., mai 2001. Web. 27 martie 2017
3. El, Shan L. "Northern blot." Metode în enzimologie. Biblioteca Națională de Medicină din S.U.A., 2013. Web. 27 martie 2017

Datorită fotografiei:
1. "Schema Northern Blot" de RNA405 - Activitate proprie (Public Domain) prin Commons Wikimedia
2. "Western blot 114A" de Amanthabagdon - Lucrare proprie (Public Domain) prin Commons Wikimedia