Cum marcherele fluorescente ajută la determinarea unei secvențe de nucleotide

Secvențierea ADN este o tehnică care ajută la determinarea secvenței nucleotidice a unei molecule ADN particulare. Cele două metode de secvențiere sunt secvențializarea lui Sanger și secvențierea următoarei generații. Ambele tipuri de metode de secvențiere sunt complet automatizate la zi. Orice tip de ADN este compus din cele patru nucleotide: adenina (A), guanina (G), citozina (C) și timina (T). Nucleotidele din fragmentul ADN sunt marcate cu patru markeri fluorescenți separați în ambele tipuri de metode de secvențiere. Marcatorii fluorescenți sau fluoroforii sunt molecule capabile să absoarbă lumina și să o emită la o lungime de undă bine definită. Marcatorii fluorescenți sunt încorporați în catena ADN prin PCR. Apoi secvența nucleotidelor se determină prin tehnici automate.

Domenii cheie acoperite

1. Ce este Sequencing
     - Definiție, Sequencing Sanger, Sequencing de generație următoare
2. Cum marcherele fluorescente ajută la determinarea unei secvențe de nucleotide
     - Procedura de secvențiere

Termeni-cheie: dideoxinucleotide (ddNTPs), marker fluorescent, electroforeză pe gel, secvență de generație următoare, secvență de nucleotide, PCR, secvențiere Sanger

Ce este Sequencing

Secvențierea este o tehnică de laborator utilizată pentru a determina secvența de nucleotide a unei molecule ADN. Două tipuri principale de metode de secvențiere a ADN-ului pot fi identificate ca secvențierea lui Sanger și secvențierea următoarei generații. Atât secventierea Sanger, cât și secvențierea următoarei generații utilizează nucleotide marcate cu fluorescență pentru determinarea secvenței nucleotidice.

Sanger Sequencing

Serializarea Sanger este prima metodă dezvoltată de secvențiere a ADN-ului. Metoda de secvențiere a fost inițial dezvoltată de Fredric Sanger în 1975. Prin urmare, este cunoscută ca secvențierea lui Sanger. Metoda de secvențiere Sanger este, de asemenea, cunoscută sub numele de metoda de terminare a lanțurilor deoarece este implicată în încorporarea selectivă a dideoxinucleotidelor terminatoare de lanț (ddNTPS) prin ADN polimerază în timpul in vitro Sinteza ADN. Elongația lanțului ADN este obținută prin deoxynucleotidele regulate (dNTPs). Cu toate acestea, ddNTP-urile sunt adăugate la amestecul de reacție pentru a termina creșterea lanțului. Aceste ddNTP sunt marcate fluorescente. Cele patru tipuri de ddNTP sunt adăugate la patru amestecuri PCR separate. Prin urmare, patru reacții PCR separate se efectuează prin adăugarea ddATP, ddGTP, ddCTP și ddTTP. În fiecare amestec de reacție, creșterea lanțului este terminată la fiecare nucleotid A, G, C și respectiv T. Ca exemplu, în amestecul de reacție cu adăugat ddATP, creșterea diferitelor ampliconi este terminată la fiecare nucleotidă A din fragmentul ADN. Apoi, aceste patru reacții sunt separate prin electroforeză pe gel și se utilizează un fluorometru pentru a scana fluorescența separată. Secvențierea lui Sanger este larg utilizată pentru determinarea secvenței fragmentelor utilizate în clonarea ADN și fragmentele amplificate prin PCR. Secvențele de nucleotide determinate sunt prezentate în figura 1.

Figura 1: Secvențe ADN

Urmărirea următoarelor generații

Cele mai recente tehnologii de secventiere a ADN-ului sunt colectiv cunoscute ca secventiere de generatie urmatoare. Reacțiile de secvențiere sunt efectuate în microscară pe un cip simultan. Prin urmare, mai multe reacții de secvențiere sunt efectuate în paralel. În secvențierea de generație următoare se utilizează electroforeza capilară în plus față de electroforeza pe gel pentru separarea amiconilor cu diferite lungimi create prin metoda terminării lanțului. Electroforeza capilară este o metodă de separare analitică prin care moleculele sunt separate pe baza mobilității lor electroforetice.

Cum ajută factorii fluorescenți să determine o secvență de nucleotide

În timpul secvențierii, ADN-ul care urmează a fi secvențiat servește ca lanț de șablon pentru sinteza ADN-ului prin PCR. Un primer ADN este utilizat pentru inițierea sintezei ADN prin ADN polimerază. Un amestec de patru baze regulate (dNTP, dATP, dGTP, dCTP, dTTP) și un nivel scăzut al uneia dintre cele patru dideoxinucleotide (ddNTPs, ddATP, ddGTP, ddCTP și ddTTP) sunt adăugate ca componente ale reacției PCR. Prin urmare, patru reacții PCR individuale sunt efectuate prin adăugarea fiecăruia dintre cele patru ddNTP-uri. Dideoxinucleotidele posedă două caracteristici speciale:

1. Nu le lipsește gruparea 3'-OH la care nucleotida primită este adăugată prin ADN polimerază. Prin urmare, încorporarea ddNTP termină creșterea lanțului.
2. Ele sunt etichetate cu diferiți coloranți fluorescenți: ddATP este marcat cu un colorant verde, ddGTP este marcat cu un colorant galben, ddCTP este marcată cu albastru, si ddTTP este marcat cu colorant roșu.

Cu toate acestea, lanțurile terminând ddNTPs sunt adăugate în concentrații scăzute; acestea nu termină imediat întregul proces PCR. Dar, atunci când una din cele patru ddNTP-uri sunt încorporate în lanțul de creștere, această creștere a lanțului special este terminată. Prin urmare, la sfârșitul fiecărei patru reacții PCR, se produc o serie de ampliconi (fragmentele ADN rezultate prin PCR), care sunt terminate la fiecare nucleotidă a fragmentului ADN țintă. Aceste amplicoane pot fi administrate într-un gel. Coloranții fluorescenți care trec la un punct definit al gelului electroforetic pot fi scanați cu ajutorul unui fluorometru pentru a determina secvența de nucleotide din secvențele automate de ADN. Secvența nucleotidică marcată cu fluorescență obținută în secvențierea ADN este prezentată în secvența figura 2.

Figura 2: Secvența de nucleotide marcate cu fluorescență

Prin combinarea fiecăruia dintre nucleotidele din serie, poate fi determinată secvența de nucleotide a fragmentului inițial de ADN. Secvența nucleotidică a unui fragment cu 750-1000 de perechi de baze poate fi determinată cu ușurință pe parcurs prin secvențierea lui Sanger. Cu toate acestea, secvențierea unui genom întreg continuă să fie contestabilă datorită prezenței unui număr mare de nucleotide. 454 de secvențiere este un tip de secvențiere de generație următoare, prin care 20 de milioane de perechi de baze pot fi citite pe un singur ciclu.

Concluzie

Secvențierea este o tehnică utilizată pentru determinarea secvenței de nucleotide a unui fragment de ADN special. Serializarea Sanger și secvențierea următoarei generații sunt cele două tehnologii principale de secvențiere. Ambele tehnologii utilizează markeri fluorescenți pentru determinarea secvenței de nucleotide. Fiecare dintre cele patru dideoxinucleotide terminatoare de lanț este marcată cu patru coloranți fluorescenți diferiți și sunt utilizați în patru reacții PCR separate pentru a obține secvența.

Referinţă:

1. Adams, Jill U. "Tehnologii de secvențiere a ADN-ului", Nature News, Nature Publishing Group, disponibil aici.
2. Carr, Steven M. Sequencing fluorescent, disponibil aici.
3. "Sequencing DNA - Secvență automată cu coloranți fluorescenți". Articolele JRank, disponibile aici.

Datorită fotografiei:

1. "Alineando secuencias (2)" de Shaury Nash (CC BY-SA 2.0) prin Flickr
2. "Securitate fluorescentă radioactivă" de Abizar la Wikipedia în engleză (CC BY-SA 3.0) prin Wikimedia Commons