Cum functioneaza Illumina Sequencing

Illumina sequencing este o metodă de secvențiere de generație următoare, care este numită și "secvențiere prin sinteză". Sequencingul ilumina este implicat în procesarea a milioane de fragmente în paralel. Cei patru pași principali implicați în fluxul de lucru al secvențializării Illumina sunt pregătirea bibliotecii, generarea de clustere, secvențierea și analiza datelor, care sunt descrise în continuare în acest articol.

Domenii cheie acoperite

1. Ce este Illumina Sequencing
     - Definiție, fapte, avantaje
2. Cum functioneaza Illumina Sequencing
     - Procesul de secvențiere Illumina:
          - Pregătirea Bibliotecii
          - Generarea clusterelor
          - secvenţierea
          - Analiza datelor

Termeni-cheie: generarea de clustere, analiza datelor, secvențierea Illumina, pregătirea bibliotecii, secvențierea prin sinteză

Ce este Illumina Sequencing

Illumina Tehnologia de secvențiere sau secvențiere-sinteză (SBS) este cea mai răspândită tehnologie de secvențiere de generație următoare din lume. Mai mult de 90% din datele de secvențiere ale lumii sunt generate de secvențierea Illumina. Acesta a fost inițial dezvoltat de Shankar Balasubramanian și David Klenerman de la Universitatea din Cambridge. Ei au înființat o companie cunoscută sub numele de Solexa în 1998. Ulterior, Illumina a cumpărat Solexa în 2007, îmbunătățind rapid tehnologia originală. Prin urmare, se mai numește și metoda Metoda de secvențiere Solexa / Illumina. Principalul avantaj al secvențierii Illumina este că oferă un randament ridicat de citiri fără erori.

Cum functioneaza Illumina Sequencing

Cele patru etape implicate în secvențierea Illumina sunt descrise mai jos.

Pasul 1. Pregătirea Bibliotecii

• O bibliotecă de secvențiere este pregătită simultan tagmentation de ADN în segmente scurte de 200-600 de perechi de baze de către transposaze într-un proces cunoscut sub numele de tagmentare, urmată de ligarea adaptorului în ambele capete 3 'și 5' ale segmentelor scurte ale ADN.
• Motivele suplimentare, cum ar fi site-ul de legare a secvenței de primer, indexul și o regiune, care este complementară oligo celulară de flux, sunt adăugate la adaptor pe ambele părți prin amplificarea ciclului redus. Marcarea și adăugarea de motive sunt afișate în figura 1.

Figura 1: Marcarea și adăugarea motivelor

Pasul 2. Generarea clusterelor

• Biblioteca de secvențiere pregătită este denaturată și încărcată în a flux de celule pentru generarea de clustere. În timpul generării de clustere, fiecare fragment din biblioteca de secvențiere este amplificat izotermic. Celula de flux este alcătuită din sticlă care conține benzi. Fiecare bandă este acoperită cu două tipuri de oligonucleotide. Un tip este complementar regiunii 5 'a motivelor adiționale, iar celălalt tip este complementar regiunii 3' a motivelor adiționale ale bibliotecii pregătite. Prin urmare, aceste oligo-uri se leagă la regiunile corespunzătoare ale ADN din biblioteca de secvențiere. Celula de flux cu două tipuri de oligo este prezentată în figura 2. Oligo care se leagă la regiunea 5 'a bibliotecii de secvențiere este de culoare roz în timp ce oligo care se leagă la regiunea 3' a bibliotecii de secvențiere este de culoare verde.

Figura 2: Celula de flux

• Odată ce biblioteca de secvențiere monocatenară este legată de oligo, lanțul complementar este generat de ADN polimeraza. Apoi, ADN-ul dublu catenar rezultat este denaturat și faza originală este spălată.
• amplificare clonală a fragmentului este realizat prin amplificarea podurilor. În timpul acestui proces, lanțul se îndoaie deasupra celui de-al doilea tip de oligo pe celula de flux. Apoi, polimeraza sintetizează podul dublu-catenar. Denaturarea podului are ca rezultat două fire de ADN: ambele direcții înainte și inversă pe oligoelementele celulei de flux.
• Amplificarea punții se repetă continuu pentru a obține simultan milioane de clustere de toate tipurile de fragmente din biblioteca de secvențiere prin amplificare clonală. Amplificarea clonală este prezentată în figura 3.

Figura 3: Amplificarea clonală

• Apoi, firele inverse sunt spălate, reținând numai firul din față pe celula de curgere. În partea frontală, capătul 3 'este liber și este blocat pentru a preveni amorsarea nedorită.

Pasul 3. Sequencing

Prima citire a secvenței inverse

• Secvențierea începe cu extinderea primului primer de secvențiere. Metoda de secvențiere Illumina utilizează dNTP-uri modificate, care conțin un terminator în poziția 3 'a zahărului dezoxiriboză. Aceste dNTP-uri sunt, de asemenea, etichetate fluorescent în diferite culori.

• După adăugarea fiecărei nucleotide complementare, se observă clusteri în celula de flux pentru emisia de fluorescență.

• După detectarea luminii, fluoroforul poate fi spălat.

• Apoi, grupul terminator al poziției 3 'a zahărului este regenerat printr-o grupare hidroxil, permițând adăugarea unui al doilea dNTP la lanțul de creștere. Acest proces este cunoscut ca secvențierea după sinteză. Secvența de sinteză este prezentată în figura 4.

Figura 4: Sequencing-by-Synthesis

• La finalizarea sintezei, prima citire a secvenței inverse se obține și produsul de secvențiere este spălat.

Indicele 1 Citiți

• Primerul index 1 este apoi hibridizat la grupuri pentru a genera oa doua citire în același mod prin secvențiere-sinteză. Produsul de secvențiere este spălat.

Indicele 2 Citiți

• Capătul 3 'al clusterului este apoi deprotejat, permițând hibridizarea capătului 3' cu cel de-al doilea tip de oligo pe celula de curgere (culoarea verde). Prin aceasta se obține secvența regiunii index 2. Produsul de secvențiere este spălat.

A doua citire a secvenței viitoare

• Al doilea tip de oligo este extins de o polimerază, formând o punte dublă catenară. Podul este denaturat și capetele lui 3 'sunt blocate. Partea din față este spălată.
• a doua citire a secvenței directe se obține prin secvențierea prin sinteză prin hibridizarea și extinderea primului primer de secvențiere.

Pasul 4. Analiza datelor

• Mii de citiri obținute prin secvențiere sunt grupate pe baza secvențelor lor index.
• Apoi, secvențele cu citiri similare sunt grupate.
• Înainte și înapoi citirile sunt asociate pentru a forma secvențe contigue.
• Alinierile ambigue pot fi rezolvate prin secvențe asociate.
• Secvențele contigue sunt aliniate la genomul de referință pentru identificarea variantelor.

Următorul videoclip explică întregul proces de secvențiere Illumina.

Concluzie

Secvențierea Illumina este o metodă de secvențiere de generație următoare. Sequencingul ilumina este implicat în pregătirea unei biblioteci de secvențiere cu 200-600 de perechi de baze lungi de fragmente de ADN. Cele patru etape implicate în secvențierea Illumina sunt pregătirea bibliotecii, generarea de clustere, secvențierea și analiza datelor. Deoarece secvențierea Illumina dă o secvență de citire cu o precizie ridicată, este metoda de secvențiere folosită pe scară largă în lume.

Referinţă:

1. "Sequencing by Sinteza (SBS) Technology". Tehnologie de secvențiere Sequencing prin sinteză, Disponibil aici.

Datorită fotografiei:

1. "Pregătirea procesării ADN-ului" de către DMLapato - Lucrări proprii (CC BY-SA 4.0) prin Wikimedia Commons
2. "Lanțurile de oligonucleotide în celulele de flux" de DMLapato - munca proprie, (CC BY-SA 4.0) prin Wikimedia Commons
3. "Sequencing by sinteze Terminatorii reversibili" de Abizar Lakdawalla (vorbesc) - Am creat această lucrare în întregime de mine (CC BY-SA 3.0) prin Wikimedia Commons
4. "Generarea de clustere" de către DMLapato - Activitate proprie (CC BY-SA 4.0) prin Wikimedia Commons