Cum functioneaza Southern Blotting?

Blocarea Southern este o tehnică utilizată pentru detectarea fragmentului ADN specific într-o probă. Tehnica de blot implică separarea fragmentelor ADN pe baza mărimii prin electroforeză pe gel, transferarea probei de ADN fracționată în mărime pe o membrană de filtrare, hibridizarea fragmentelor ADN specifice cu o sondă specifică secvenței marcată și detectarea benzilor marcate.

Pe lângă identificarea ADN-ului specific într-o probă, mărimea și abundența unui anumit tip de ADN pot fi de asemenea determinate prin Southern blotting. Procesul implicat în blotarea Southern este descris în acest articol.

Domenii cheie acoperite

1. Ce este Southern Blotting
     - Definiție, principiu, aplicații
2. Cum functioneaza Southern Blotting?
     - Procesul de blotare sudică

Termeni cheie: ADN, electroforeză pe gel, probă de hibridizare, membrană de nailon, digestie cu restricție, blot sudic

Ce este Southern Blotting

Southern blotting este o tehnică de hibridizare utilizată pentru identificarea ADN-ului specific într-o probă. Tehnica a fost inițial dezvoltată de Edward M. Southern în 1975. Acest proces identifică secvențele ADN, mărimea și abundența unei secvențe ADN particulare într-un eșantion.

O membrană Southern blotting este prezentată în figura 1.

Figura 1: Membrană de blot sudică

Aplicații ale Southern Blotting

Aplicările Southern blotting sunt descrise mai jos.

1. Pentru a detecta un fragment ADN special
2. Pentru a izola un fragment de ADN special
3. Pentru a identifica mutațiile și rearanjamentele genetice
4. În analizele RFLP (polimorfismul lungimii fragmentului de restricție)
5. Pentru a identifica bolile genetice
6. Identificarea agenților infecțioși
7. Test de paternitate
8. În amprentarea ADN-ului pentru a identifica criminalii

Cum functioneaza Southern Blotting?

Blocarea Southern implică separarea fragmentelor ADN pe baza mărimii prin electroforeză în gel, transferul lor într-o membrană, hibridizarea acestora cu o sondă specifică secvenței marcate și detectarea benzilor marcate. Etapele Southern blotting sunt descrise mai jos.

1. Digestia ADN - Proba ADN este digerată cu enzime de restricție pentru a obține fragmente de ADN și aceste fragmente sunt amplificate prin PCR.
2. Gel electrophoresis - Fragmentele ADN sunt fracționate în mărime prin electroforeză pe gel.
3. denaturarea - Gelul cu ADN fracționat este înmuiat în NaOH sau HCI pentru a denatura ADN dublu catenar.
4. sugativă - Fragmentele ADN din gel sunt transferate într-o membrană nylon încărcată pozitiv printr-un proces numit blotting.
5. Coacerea și blocarea - Hârtia blotantă cu fragmente de ADN este coaptă pentru a fixa ADN-ul pe membrană. Apoi, locurile de legare neocupate sunt saturate prin tratarea cu albumină serică bovină (BSA) sau cazeină.
6. Hibridizarea cu sonde marcate - Membrana legată la ADN este tratată cu o probă marcată care conține secvența de nucleotide complementară fragmentului ADN interesat. Sondele de hibridizare sunt în general lungi de 100-500 bp și sunt marcate cu nucleotide radioactive.
7. Vizualizare prin autoradiogramă - Membrana legată de sondă este vizualizată sub autoradiogramă pentru a obține tiparele fragmentului ADN interesat.

Figura 2: Blotarea Southern

Întregul proces al Southern blotting este prezentat în figura 2.

Concluzie

Blotarea Southern este o tehnică de hibridizare utilizată pentru identificarea secvențelor ADN specifice dintr-o probă. În acest proces, proba ADN este fracționată prin enzime de restricție, iar amestecul este condus pe gel. Apoi, modelul de bandaj din gel este transferat într-o membrană de nailon și hibridizat cu o probă marcată, care permite detectarea fragmentului interesat.

Referinţă:

1. "Blotul de Sud". Thermo Fisher Scientific, Disponibil aici.

Datorită fotografiei:

1. "Membrană cu blot sudic" de Bojan Žunar - Lucrări proprii (CC BY-SA 4.0) prin Wikimedia Commons
2. "Figura 17 01 05" Prin CNX OpenStax - (CC BY 4.0) prin Wikimedia Commons