Cum se izolează mARN din ARN total

Combinațiile oligo-dT / purtător sunt utilizate în principal în purificarea ARNm de la ARN total printr-o tehnică cunoscută ca cromatografie de afinitate. Există două metode principale de izolare a ARNm de la ARN total pe baza tipului de celule; și anume, metoda directă de izolare a mRNA și metoda minus de izolare a ARNm. Ambele metode sunt explicate în acest articol.

Messenger ARN (mRNA) este un produs al transcripției, care este alcătuit dintr-o serie de nucleotide ARN. Acesta transporta informatii in gene de la nucleu la citoplasma pentru sinteza proteinelor. Izolarea ARN dintr-o linie celulară determină ARN total, care constă din rRNAs și tRNAs împreună cu ARNm. Prin urmare, ARNm trebuie separat de amestecul de ARN total în timpul studiului transcriptomului liniei celulare. Proprietățile unice ale ARNm, cum ar fi prezența unei coaguri poli (A) la capătul 3 'al moleculei mRNA, sunt utilizate pentru separare. Deoarece moleculele oligo-dT sunt complementare la coada poli (A), ARNm poate fi izolat dintr-un amestec de ARN total.

Domenii cheie acoperite

1. Ce este ARNm
- Definiție, structură, funcție
2. Care este compoziția ARN-ului total
- ARNm, ARNm, ARNm
3. Cum se izolează mARN din ARN total
- Utilizarea moleculelor Oligo-dT / Carrier

Termeni-cheie: Cromatografie de afinitate, ARN-ul Messenger (mRNA), Metoda minus, Oligo dT, coada Poly (A), ARN total

Ce este ARNm

ARNm este o transcripție a unei gene care codifică proteine. Acesta este produs în interiorul nucleului în eucariote și transmite informația pentru producerea unei proteine particulare în citoplasmă. Se traduce într-o secvență de aminoacizi a proteinei în timpul traducerii, asistată de ribozomi. Transcrierea primară produsă prin transcripția eucariotelor se numește pre-mARN.

Figura 1: Structura mRNA

În timpul modificărilor post-transcripționale, se obține o moleculă de ARNm matur cu câteva caracteristici cum ar fi capacele 5 'și coada poli (A). ARNm total a unui organism particular este cunoscut ca transcriptomul său.

Care este compoziția ARN-ului total

Rezultatul izolării ARN-ului este numit ARN total. Acesta este compus din toate cele trei tipuri principale de ARN produse de o celulă. Acestea sunt ARNm, tRNA și ARNm. Atât tARN cât și rARN ajută la traducere. Dimensiunea ARNm eucariote este de 0,5-20 kb. Transferul ARN (tARN) aduce aminoacizii corespunzători în timpul traducerii. Este lung de 76-90 de perechi de baze și este compusă din regiunea anticodonă, care este complementară unui codon particular pe ARNm. ARN-ul ribozomal (rRNA) este o componentă a ribozomilor. Unele dintre rRNA-urile umane sunt lungi de 5 kb.

Peste 90% din ARN total este compus din tARN și rRNA. Doar 1-5% din ARN total este ARNm. O celulă tipică de mamifere poate consta din aproximativ 500000 molecule ARNm per celulă. Cantitatea unui anumit tip de ARNm poate fi de 15-20.000 de exemplare pe celulă.

Cum se izolează mARN din ARN total

Un număr de tehnici de biologie moleculară, cum ar fi construcția bibliotecii cADN, prepararea probelor pentru prepararea microarray, analiza Northern blot pentru gene slab exprimate, etc. necesită ARNm de înaltă calitate. Există două metode principale de izolare a ARNm din ARN total pe baza tipului de celule: metoda directă de izolare a ARNm și metoda minus de izolare a ARNm.

Metoda directă de izolare a ARNm

Principiul separării ARNm matur din ARN total eucariotic implică cromatografia de selectare a afinității / afinitate a ARNm poliadenilat cu utilizarea oligo dT (oligodeoxtimidilat), care este complementar cu coada poli (A). Este posibilă prin absența unei coajă poli (A) în celelalte două tipuri de ARN: tRNA și rRNA.

ARNm este format din 30-200 nucleotide de adenină în coada poli (A). Coloanele de afinitate umplute cu o combinație oligo dT / purtător sunt utilizate în izolarea ARNm de la ARN total. Combinația oligo dT / purtător poate fi fie oligo dT legată de celuloză, oligo dT biotinilată cu granule magnetice cuplate cu streptavidină sau granule polistiren-latex cuplate cu oligo dT. Toate condițiile experimentale trebuie să fie în condiții fără RNază pentru a preveni descompunerea enzimatică a ARN.

Figura 2: Cromatografie de afinitate

ARN-ul total ar trebui să fie dizolvat într-un tampon de sare mare și încălzit ușor la 65-70 ° C pentru a perturba structurile secundare ale ARN. Condițiile de izolare a ARN variază între kiturile disponibile comercial pentru izolarea mRNA. Cu toate acestea, prepararea poli (A)-ARN sau ARNm este compusă din trei etape.

Hibridizarea poli (A) -RNA la moleculele oligo dT conectate la un purtător
Spălarea ARN-ului nelegat
Eluția poli (A) -RNA din combinația oligo-dT / purtător în condiții de stringență redusă

Metoda Minus de Izolare mRNA

Prin purificarea pe bază de oligo dT a ARNm se obțin numai mRNA cu o coadă poli (A) sau cu mARN eucariot matur. Prin urmare, o altă metodă cunoscută sub numele de metoda minus poate fi utilizată în purificarea ARNm care nu are coadă poli (A). Această metodă poate fi utilizată în izolarea mRNA din drojdie și ARN total bacterian. Acesta poate fi, de asemenea, utilizat în izolarea tipului imatur de mRNA împreună cu ARNm matur din celule eucariote. Aceasta implică îmbogățirea transcriptomului prin epuizarea ARN ribozomal mare din ARN total. The RiboMinus^TM Kitul de izolare transcriptomic de la ThermoFisher Scientific utilizează trei etape în purificarea eficientă a ARNm din drojdie și ARN total bacterian.

Hibridizarea ARN-ului total cu sonde oligonucleotidice marcate cu biotină 5 'cu secvența rRNA
Eliminarea complexului de probă marcat cu rRNA / 5'-biotină împreună cu granulele magnetice acoperite cu streptavidină
Purificarea impurităților și eluarea ARNm.

Concluzie

ARN-ul total este compus din cele trei tipuri principale de ARN: mRNA, rRNA și tARN. Purificarea ARNm de la ARN total este esențială pentru analiza transcriptomului unui anumit organism. Metodele de purificare se bazează pe tipul de ARNm. RNA mRNA, care conține o coadă poli (A), poate fi izolată prin cromatografie de afinitate cu oligo dT. RNAm eukaryotic imatur și mRNA din celulele de drojdie și bacteriene pot fi izolate prin epuizarea ARN-ului mare din ARN-ul total.

Referinţă:

1. "Extragerea mRNA". Thermo Fisher Scientific, disponibil aici.
2. "Extracția ARN prin tipul de ARN". Thermo Fisher Scientific, disponibil aici.

Datorită fotografiei:

1. "ARNm matur" (CC BY-SA 3.0) prin Wikimedia Commons
2. "Affinity" De la Jamit la Wikibooks - Wikicitat - Transferat de la en.wikibooks to Commons de Adrignola folosind CommonsHelper (Public Domain) prin Wikimedia Commons Wikimedia

Ştiinţă