De ce se utilizează PCR în procesul de secvențiere ADN

Secvențierea ADN-ului este o tehnică utilizată pentru a determina secvența nucleotidică a unui fragment ADN special. Secvențierea lui Sanger și secvențarea următoarei generații sunt două tipuri de metode de secvențiere. Indicatorii fluorescenți sunt utilizați pentru a identifica fiecare nucleotid în secvență. PCR este utilizat pentru încorporarea markerilor fluorescenți în fragmentul ADN. PCR (reacția în lanț a polimerazei) este o tehnică utilizată în laborator pentru a produce milioane de copii ale unui fragment ADN special. Analiza fragmentelor PCR din gel permite determinarea secvenței nucleotidice a fragmentului ADN.

Domenii cheie acoperite

1. Ce este Sequencing
     - Definiție, Tipuri de secvențiere - Sequencing de generație următoare, Sequencing Sanger
2. De ce se utilizează PCR în procesul de secvențiere ADN
    - Includerea coloranților fluorescenți în timpul PCR

Termeni-cheie: ddNTPs, dNTPs, secvențiere ADN, coloranți fluorescenți, secvențiere de generație următoare, PCR, secvențiere Sanger

Ce este Sequencing

Secvențierea este o tehnică de laborator utilizată pentru a determina secvența de nucleotide a unei molecule ADN. Serializarea Sanger și secvențializarea următoarei generații sunt cele două metode principale de secvențiere a ADN-ului. Ambele metode de secvențiere a ADN-ului sunt implicate în încorporarea factorilor de producție fluorescenți în lanțul ADN-ului prin PCR pentru determinarea secvenței de nucleotide a unei anumite catene de ADN.

Sanger Sequencing

Prima metodă de secvențiere, care este cunoscută ca secvențierea lui Sanger, este dezvoltată pentru prima dată de către Fredric Sanger în 1975. Prin urmare, este cunoscută ca secvențierea lui Sanger. Secvențierea lui Sanger este implicată în încorporarea selectivă a dideoxinucleotidelor terminatoare de lanț (ddNTPS) prin ADN polimerază în timpul in vitro Sinteza ADN. Prin urmare, este cunoscută și ca metoda de terminare a lanțului. Dexonucleotidele regulate (dNTPs) sunt utilizate pentru alungirea catenei ADN. ddNTP-urile sunt, de asemenea, adăugate la amestecul de reacție pentru terminarea creșterii lanțului. Cele patru tipuri de ddNTP sunt adăugate la patru amestecuri PCR separate. Prin urmare, patru reacții PCR separate se efectuează prin adăugarea ddATP, ddGTP, ddCTP și ddTTP. Pentru fiecare amestec de reacție, un singur tip de ddNTP adăugat (dacă este adăugat ddATP), creșterea fiecărei nucleotide (A) în fragmentul ADN se termină cu creșterea diferitelor ampliconi. Apoi, cele patru reacții sunt separate prin electroforeză pe gel. Fluorescența care emite este detectată de un fluorometru. Secvențierea lui Sanger este larg utilizată pentru determinarea secvenței fragmentelor utilizate în clonarea ADN și fragmentele amplificate prin PCR. Procedura generală a secvențierii lui Sanger este prezentată în figura 1.

Figura 1: Procesul general de secvențiere Sanger

Următoarea generație Sequencing

Următoarea generație este denumirea colectivă pentru cele mai recente tehnologii de secvențiere a ADN-ului. Mai multe reacții de secvențiere sunt efectuate în microscale pe un cip simultan în secvențierea următoarei generații. Ambele metode de secvențiere utilizează nucleotide marcate cu fluorescență care sunt încorporate în amplicon în timpul PCR, permițând determinarea secvenței de nucleotide. Lansarea completă a lanțului de markeri fluorescenți este, de asemenea, implicată în secvențierea următoarei generații. Cu toate acestea, principala diferență între secvențierea lui Sanger și secvențierea următoarei generații este utilizarea electroforezei capilare pentru separarea ampliconelor marcate în mod diferit în secvențierea următoarei generații. Electroforeza capilară este o metodă de separare analitică prin care moleculele sunt separate pe baza mobilității lor electroforetice.

De ce se utilizează PCR în procesul de secvențiere ADN

În timpul secvențierii, markerii fluorescenți ar trebui să fie încorporați în catena ADN pentru determinarea secvenței nucleotidice. Această încorporare are loc în timpul PCR. În general, cele patru tipuri de dNTPs sunt încorporate în lanțul ADN nou-sintetizator în timpul PCR. Acest fenomen este utilizat în secvențierea ADN-ului pentru a încorpora dideoxinucleotidele marcate cu fluorescență (ddNTPs) în amplicon în timp ce se determină secvența ADN.

În general, la amestecul de reacție PCR se adaugă un amestec de patru baze regulate (dNTPs, dATP, dGTP, dCTP, dTTP) în timpul secvențierii ADN.

În plus, una dintre cele patru dideoxinucleotide (ddNTP, ddATP, ddGTP, ddCTP și ddTTP) sunt adăugate ca componente ale reacției PCR într-o concentrație scăzută. În cele din urmă, trebuie efectuate patru reacții PCR pentru a determina secvența completă. 

Figura 1: O secvență ADN determinată

ddNTP-urile nu au o grupă 3'-OH la care nucleotida primită este adăugată prin ADN polimerază. Prin urmare, încorporarea ddNTP termină creșterea lanțului. Astfel, în fiecare dintre cele patru reacții PCR, terminarea lanțului are loc la o anumită bază. Aceste ddNTP-urile sunt, de asemenea, încorporate cu diferiți coloranți fluorescenți (The ddATP este marcat cu colorant verde; ddGTP este marcat cu colorant galben; ddCTP este marcată cu albastru, si ddTTP este marcat cu colorant roșu). Încorporarea coloranților fluorescenți și terminația lanțului are loc în timpul PCR. Amplionii se execută pe un gel și gelul este scanat pentru fluorescență printr-un fluorometru în secvența automată pentru determinarea secvenței nucleotidice.

Concluzie

Secvențierea ADN este o tehnică de laborator utilizată pentru a determina secvența nucleotidică a unui fragment ADN special. Secvențierea Sanger și secvențierea următoarei generații încorporează diferiți coloranți fluorescenți în fragmentul ADN pentru determinarea secvenței de nucleotide în timpul unei PCR.

Referinţă:

1. Adams, Jill U. "Tehnologii de secvențiere a ADN-ului", Nature News, Nature Publishing Group, disponibil aici.
2. "Sequencing DNA - secvență automată cu coloranți fluorescenți". Articolele JRank, disponibile aici.

Datorită fotografiei:

1. "Sanger de secvențiere - generală" Autor: Utilizator: Fibonachi - roșu (CC BY-SA 1.0) prin Wikimedia Wikimedia [modificat]