Diferența dintre PCR și secvențierea ADN

Diferența cheie - PCR vs secvențierea ADN
 

PCR și secvențierea ADN sunt două tehnici importante în Biologie Moleculară. Reacția lanțului de polimerază (PCR) este procesul care creează un număr mare de copii ale fragmentului ADN. Secvențierea ADN este tehnica care are ca rezultat ordinea exactă a nucleotidelor unui fragment ADN dat. Aceasta este diferența cheie dintre PCR și secvențierea ADN-ului. PCR este unul dintre etapele majore implicate în secvențierea ADN-ului.

CUPRINS
1. Prezentare generală și diferență cheie
2. Ce este PCR
3. Ce este secventierea ADN-ului
4. Comparație de la o parte la alta - Sequencing PCR vs. ADN
5. rezumat

Ce este PCR?

Reacția lanțului de polimerază (PCR) este o tehnică de amplificare ADN utilizată în Biologie Moleculară. Produce mii până la milioane de copii ale unui fragment specific de ADN. Această metodă a fost dezvoltată de Kary Mullis în 1983. În această tehnică, fragmentul de ADN care trebuie amplificat servește ca șablon și enzima ADN polimerază adaugă nucleotide complementare la primerul care este disponibil în amestecul PCR. La sfârșitul reacției PCR, sunt sintetizate mai multe copii ale probei ADN.

Există diferite componente ale amestecului PCR, incluzând ADN, polimeraza ADN (polimerază Taq), primeri (primeri invers și invers), nucleotide (blocuri de construcție ale ADN) și tampon. PCR se întâmplă în interiorul unei mașini PCR și amestecul corect PCR trebuie încărcat în mașină, iar programul corect trebuie condus. Această tehnică permite producerea a mii până la milioane de copii dintr-o anumită secțiune a ADN-ului dintr-o cantitate foarte mică de ADN.

Reacțiile PCR apar în mod ciclic pentru a produce cantitatea vizibilă de produse PCR pe un gel. Există trei etape majore implicate într-o reacție PCR, și anume denaturarea, recoacerea primerului și extensia benzii așa cum se arată în Figura 01. Acești trei pași se întâlnesc la trei temperaturi diferite. ADN-ul există în formă dublu catenară prin legături de hidrogen între bazele complementare. Înainte de implicare, ADN-ul dublu catenar trebuie separat unul de altul. Se face prin acordarea unei temperaturi ridicate. La o temperatură ridicată, ADN-ul dublu catenar denaturează în singure fire. Apoi primerii trebuie să vină mai aproape de capetele flancate ale fragmentului specific sau genei ADN-ului. Primerul este o piesă scurtă de ADN monocatenar care este complementară secvenței țintă. Analizoarele înainte și inversate se recuperează cu bazele complementare la capetele flancene ale probei ADN-ului denaturat la temperatura de recoacere. Grundurile trebuie să fie rezistente la căldură. Odată ce primerii se reconectează cu ADN-ul probei, enzima taq polimerază inițiază sinteza noilor fire prin adăugarea de nucleotide care sunt complementare ADN-ului țintă. Taq polimeraza este o enzimă stabilă la căldură izolată dintr-o bacterie termofilă numită Thermus aquaticus. Tamponul PCR menține condițiile optime pentru acțiunea taq polimerază. Aceste trei etape ale reacțiilor PCR sunt repetate pentru a produce cantitatea necesară de produs PCR. După fiecare reacție PCR, numărul copiei ADN este dublat. Astfel, o amplificare exponențială poate fi observată în PCR. Produsele PCR pot fi observate utilizând electroforeza în gel și pot fi purificate pentru studii ulterioare.

Figura 01: Etapele majore ale unei reacții PCR

PCR este un instrument valoros în cercetarea medicală și biologică. PCR are o valoare deosebită în domeniul științelor medico-legale, deoarece poate amplifica ADN-ul pentru studii din probele mici de la criminali și poate face profiluri ADN forensic. PCR este utilizat pe scară largă în multe domenii ale biologiei moleculare, incluzând genotiparea, clonarea genelor, detecția mutațiilor, secvențierea ADN-ului, microarraele ADN și testarea paternității etc..

Figura 02: Reacția lanțului de polimerază

Ce este secventierea ADN-ului?

Secvențierea ADN este determinarea unei ordini precise a nucleotidelor - adenină, guanină, citozină și timină într-un fragment ADN dat. Informațiile genetice sunt stocate în secvențele ADN folosind ordinea corectă a nucleotidelor. Prin urmare, găsirea ordinii precise a nucleotidelor într-un fragment ADN este foarte importantă pentru a cunoaște structura și funcția genelor.

Protocolul de secvențiere a ADN-ului implică procese diferite. Primul pas este izolarea ADN-ului interesat sau a ADN-ului genomic al unui organism. Folosind PCR (așa cum este descris mai sus), regiunea dorită a ADN-ului trebuie să fie amplificată. Produsul PCR amplificat trebuie separat prin electroforeză în gel și purificat. Fragmentele fragmentate sunt servite ca șabloane pentru secvențiere. Sequencing-ul poate fi realizat fie urmând secvențarea lui Sanger, fie prin metoda de secvențiere cu tranzit mare. Sequencingul Sanger necesită electroforeză capilară a fragmentelor ADN rezultate. Determinarea ordinii corecte a nucleotidelor se poate face prin citirea manuală a autoradiografilor sau prin utilizarea secvențiatorilor ADN automatizați.

Secventierea genelor a contribuit la proiectul genomului uman si a facilitat cartografierea genomului uman in 2003. In criminalistica, secventierea ADN-ului a permis identificarea indivizilor care prezinta secvente ADN unice si identificarea infractorilor. In medicina, secventierea ADN-ului poate fi folosita pentru a detecta genele responsabile pentru bolile genetice si alte boli, pentru a gasi gene defecte si a le inlocui cu gene corecte. În agricultură, informațiile secvențializării ADN ale unor microorganisme sunt folosite pentru a produce culturi transgenice cu caracteristici economice dorite.

Figura 03: Sequencing-ul ADN-ului

Care este diferența dintre PCR și secvențierea ADN-ului?

Secvențierea PCR vs. ADN
Procesul PCR creează mii până la milioane de copii ale fragmentului ADN interesat.	Secvențierea ADN este procesul de determinare a ordinii precise a nucleotidelor într-un fragment ADN dat.
Rezultat
PCR creează mii până la milioane de copii ale unui fragment ADN special	Aceasta are ca rezultat ordinea corectă a bazelor într-un fragment ADN special.
Implicarea ddNTP-urilor
PCR nu necesită ddNTPs. Utilizează dNTP-uri.	Secvențierea ADN-ului necesită ddNTPs pentru a termina formarea catenei.

Rezumat - Sequencing PCR vs DNA

PCR și secvențierea ADN-ului sunt instrumente foarte importante în multe domenii ale biologiei moleculare. Amplificarea fragmentelor ADN se face prin tehnica PCR, în timp ce ordinea corectă a nucleotidelor unui fragment ADN este determinată prin secvențierea ADN-ului. Aceasta este diferența dintre PCR și secvențierea ADN-ului.

Referinţă:
1. "Reacția lanțului de polimerază (PCR)". Centrul Național de Informare Biotehnologică. Biblioteca Națională de Medicină din S.U.A., n.d. Web. 21 februarie 2017.
2. Shendure, Jay și Hanlee Ji. "Secvențierea ADN-ului de generație următoare". Nature Publishing Group, 09 octombrie 2008. Web. 21 februarie 2017

Datorită fotografiei:
1. "Etapele PCR" de către Tinojasontran - Activitate proprie (Public Domain) prin Commons Wikimedia
2. "Reacția în lanț a polimerazei" Prin Enzoklop - Lucrare proprie (CC BY-SA 3.0) prin intermediul Commons Wikimedia
3. "Secvența ADN" Prin Sjef - Activitate proprie (Domeniul Public) prin Commons Wikimedia