Diferența dintre PCR și QPCR

Diferența principală - PCR vs QPCR

PCR (reacția în lanț a polimerazei) și qPCR (PCR cantitativ) sunt două tehnici utilizate în biotehnologie pentru amplificarea ADN-ului în diverse scopuri. PCR este o tehnică relativ simplă. qPCR este, de asemenea, cunoscut sub numele de PCR în timp real sau PCR digital. principala diferență între PCR și qPCR este asta PCR este o tehnică calitativă, în timp ce qPCR este o tehnică cantitativă. PCR permite citirea rezultatului ca "prezență sau absență". Dar în qPCR, cantitatea de ADN amplificată în fiecare ciclu este cuantificată. Dacă ARN este utilizat în PCR, tehnica este cunoscută ca RT-PCR (PCR de transcriere inversă) și dacă ARN este utilizat în qPCR, tehnica este cunoscută sub numele de qRT-PC.

Domenii cheie acoperite

1. Ce este PCR
- Definiție, procese, utilizări
2. Ce este QPCR
- Definiție, procese, utilizări
3. Care sunt asemănările dintre PCR și QPCR
- Schița caracteristicilor comune
4. Care este diferența dintre PCR și QPCR
- Compararea diferențelor cheie

Termeni-cheie: electroforeza gelului de agaroză, ampliconi, ADN polimerază, colorant fluorescent, PCR, probe, qPCR, RT-qPCR

Ce este PCR

PCR se referă la o tehnică în biotehnologie care permite analiza unei secvențe scurte de ADN prin amplificarea unui segment selectat de ADN. Este o metodă relativ sensibilă, deoarece volume foarte mici sunt necesare printr-o singură reacție. Tehnica se bazează pe capacitatea ADN polimerazei de a sintetiza noi fire de ADN în lanțul șablon oferit într-o manieră complementară. Amestecul de reacție al PCR este compus din ADN polimerază, nucleotide ADN, primeri, șablonul ADN care trebuie amplificat și magneziu. Amplificarea se efectuează în interiorul unui termociclu. ADN polimeraza trebuie să fie rezistentă la căldură, deoarece temperaturile ridicate sunt utilizate în această reacție. Cele două tipuri de polimeraze ADN utilizate în PCR sunt: Taq ADN polimeraza și pfu ADN polimeraza. Taq ADN polimeraza este larg utilizată în PCR.

ADN polimeraza necesită o catenă ADN preexistentă la capătul 3 'pentru a sintetiza o nouă catenă. Prin urmare, la amestecul de reacție se adaugă un primer de oligonucleotidă pentru inițierea sintezei ADN. Cerința unui primer în PCR permite amplificarea numai a unei anumite regiuni din model. Secvența țintă este flancată de primeri și inversi. La sfârșitul unei PCR, se pun noi copii ale unei secvențe ADN specifice, numite amplicons, sunt acumulate în miliarde de euro. Componentele PCR trebuie optimizate astfel încât să îmbunătățească performanța PCR, minimizând eșecul. Reacția PCR standard este prezentată în figura 1.

Figura 1: PCR

Etapele PCR

Cele trei etape ale PCR sunt descrise mai jos.

denaturarea - Șablonul de ADN dublu catenar este separat în două toroane unice prin încălzire la 94-95 ° C.
Recoacerea - Marcatorii forward și invers se leagă de secvențele complementare din șablon. Temperatura depinde de temperatura de topire a combinației de grunduri.
Extensie de bază - Enzima ADN polimerază extinde fiecare primer la capătul 3 'prin adăugarea de baze complementare la catena de creștere. Temperatura optimă de Taq polimerază, adică 72 ° C, este utilizată ca temperatură în etapa de extensie. Timpul de prelungire depinde de numărul de perechi de baze din șirul de șablon.

Cele trei etape se repetă de 28-35 de ori. Electroforeza pe gel de agaroză este utilizată în fracționarea mărimii produselor PCR. Produsul este colorat cu bromură de etidiu și este observat sub UV. Produsul PCR sau ADN-ul amplificat poate fi utilizat în clonare, secvențiere sau genotipare.

Ce este QPCR

QPCR se referă la o tehnică în biotehnologie care permite detectarea, caracterizarea și cuantificarea acizilor nucleici pentru diverse aplicații. Prin urmare, este un tip de PCR cantitativ. Atât ADN cât și ARN pot fi utilizate ca qPCR. Dacă ARN este utilizat ca șablon, acesta ar trebui să fie transversat în primul rând în ADNc. Astfel, acest tip de qPCR este cunoscut sub numele de RT-qPCR. Traducerea PCR tradițională se efectuează pentru cADN sau proba obișnuită de ADN. Cu toate acestea, în qPCR, coloranții fluorescenți sunt utilizați pentru a marca produsul PCR în fiecare etapă a ciclului PCR. Aceasta permite colectarea de date în timp ce PCR progresează, permițând cuantificarea ampliconilor în timpul fazei exponențiale a PCR. Principalul tip de colorant utilizat în qPCR este SYBR Green. Colorantul se leagă de ADN-ul dublu catenar. Pe măsură ce fluorescența crește proporțional cu cantitatea de ADN amplificat, cuantificarea se poate face în "timp real". Principalul dezavantaj al utilizării colorantului este faptul că permite cuantificarea unui produs specific în eșantion. Pe lângă coloranți, sondele pot fi de asemenea utilizate în procesul de cuantificare. Sondele TaqMan sunt unul dintre principalele tipuri de sonde oligonucleotidice utilizate în qPCR, iar procesul de emisie de fluorescență este prezentat în figura 2.

Figura 2: Proba TaqMan

Sondele pot fi proiectate astfel încât să detecteze mai multe produse PCR din cadrul aceleiași probe. Sonda TaqMan este unul dintre principalele tipuri de sonde de hidroliză; încorporarea acestei probe în produsul PCR expune fluoroforul care emite fluorescența. Fluorescentele colorante sunt mai specifice produsului PCR. Prin urmare, ele sunt utilizate în majoritatea testelor de diagnosticare pentru a detecta produsul PCR.

Asemănări între PCR și QPCR

PCR și qPCR sunt două tipuri de tehnici utilizate în biotehnologie pentru amplificarea ADN-ului în diverse scopuri.
Reacția tradițională în lanț a polimerazei este efectuată ca tehnică de bază atât în PCR, cât și în qPCR.
ARN poate fi utilizat atât în PCR cât și în qPCR prin utilizarea transcripției inverse ca primă reacție.

Diferența dintre PCR și QPCR

Definiție

PCR: PCR este o tehnică în biotehnologie care permite analiza unei secvențe scurte de ADN prin amplificarea unui segment selectat de ADN.

QPCR: QPCR este o tehnică în biotehnologie care permite detectarea, caracterizarea și cuantificarea acizilor nucleici pentru diverse aplicații.

Cantitativ calitativ

PCR: PCR este o tehnică calitativă.

QPCR: QPCR este o tehnică cantitativă.

Detectarea produsului

PCR: Produsul este detectat prin electroforeza în gel de agaroză în PCR.

QPCR: Produsul poate fi detectat în fiecare ciclu de amplificare în qPCR.

Colectarea de date

PCR: Datele sunt colectate la sfârșitul reacției în PCR.

QPCR: Datele sunt colectate în timpul fazei exponențiale a reacției în qPCR.

Rezoluţie

PCR: PCR are o rezoluție foarte slabă.

QPCR: QPCR are o rezoluție foarte mare.

Coloranți

PCR: PCR utilizează bromură de etidiu pentru a pata produsul în timpul PCR.

QPCR: QPCR utilizează coloranți fluorescenți pentru a detecta produsul.

Timp

PCR: PCR este o metodă mai consumatoare de timp.

QPCR: QPCR consumă mai puțin timp.

ARN

PCR: RT-PCR este tipul de PCR care utilizează ARN ca șablon.

QPCR: RT-qPCR este tipul de qPCR care utilizează ARN ca șablon.

Rol

PCR: PCR este utilizat pentru a detecta prezența sau absența anumitor fragmente genomice.

QPCR: QPCR este utilizat pentru a cuantifica un anumit fragment într-o probă.

Concluzie

PCR și qPCR sunt două tipuri de tehnici utilizate în biotehnologie pentru amplificarea ADN-ului în diverse scopuri. PCR este metoda tradițională de amplificare utilizată pentru a identifica prezența sau absența fragmentului ADN. QPCR este utilizat pentru a cuantifica un anumit fragment într-o probă. Astfel, PCR este o tehnică calitativă, în timp ce qPCR este o tehnică cantitativă. Aceasta este principala diferență dintre PCR și qPCR.

Referinţă:

1. "QPCR vs. PCR digital vs. PCR tradițional". Thermo Fisher Scientific, Disponibil aici.

Datorită fotografiei:

1. "PCR" de Madprime - munca proprie (CC BY-SA 3.0) prin Wikimedia Commons
2. "Taqman" De Utilizator: Braindamaged - Muncă proprie a Uploaderului original (Domeniul Public) prin Wikimedia Commons

Ştiinţă