Cum functioneaza secventierea ADN-ului
Share
Sequencingul este procesul implicat în determinarea unei secvențe nucleotidice a unui fragment ADN special. În timpul secvențierii, fragmentul ADN este marcat termic cu nucleotide marcate cu fluorescență prin PCR. Acest proces utilizează patru tipuri de nucleotide marcate cu fluorescență și sunt dideoxinucleotide (ddNTPs). ddNTP lipsesc o grupare 3 'OH la care este atașată gruparea fosfat a nucleotidului care intră. Prin urmare, atunci când un ddNTP este adăugat la lanțul de creștere, nu va mai fi nici o adăugare de nucleotide la capătul 3 'al lanțului. Asta înseamnă că adăugarea unui ddNTP în lanțul de creștere termină creșterea lanțului. Din moment ce ddNTP-urile sunt adăugate la amestecul PCR în concentrații scăzute, fiecare lanț de creștere este terminat la nivele diferite. Fluorescenta emitatoare este detectată pentru a determina secvența de nucleotide a fragmentului ADN la sfârșitul PCR.
Domenii cheie acoperite
1. Ce este secventierea ADN-ului
- Definiție, Tipuri
2. Cum functioneaza secventierea ADN-ului
- Procesul de secvențiere ADN
Termeni-cheie: dideoxinucleotide (ddNTPs), marker fluorescent, electroforeză pe gel, secvență de generație următoare, secvență de nucleotide, PCR, secvențiere Sanger
Ce este secventierea ADN-ului
Secvențierea ADN este o tehnică de laborator utilizată pentru determinarea secvenței nucleotidice a unei molecule de ADN particulare. Folosește nucleotide marcate cu fluorescență, care sunt încorporate în timpul PCR. Există două metode principale de secvențiere pe baza tehnicilor utilizate în detectarea fluorescenței: secvențierea Sanger și secvențierea următoarei generații.
Sanger Sequencing
Secvențierea lui Sanger, dezvoltată de Fredric Sanger în 1975, este prima metodă de secvențiere dezvoltată. Este, de asemenea, cunoscut sub numele de metoda de terminare a lanțurilor de cand este implicată în încorporarea selectivă a ddNTP-uri terminatoare de lanț în timpul in vitro Sinteza ADN. În secvențierea lui Sanger, amplicoanele sunt separate prin electroforeză pe gel. Sequencingul Sanger este folosit pe scară largă pentru determinarea secvenței fragmentelor ADN utilizate în clonare și fragmentele amplificate prin PCR. O secvență ADN determinată este prezentată în secțiunea figura 1.
Figura 1: Secvențierea ADN-ului
Urmărirea următoarelor generații
Cele mai recente tehnologii de secventiere a ADN-ului sunt colectiv cunoscute ca secventiere de generatie urmatoare. Este, de asemenea, o metodă de terminare a lanțului. Următoarea generație de secvențe utilizează electroforeza capilară pentru separarea ampliconilor cu diferite lungimi create prin metoda terminării lanțului. Următoarea generație de secvențiere este utilizată pentru determinarea unui număr mare de nucleotide per ciclu, cum ar fi secvențierea genomului.
Cum functioneaza secventierea ADN-ului
În timpul secvențierii ADN, nucleotidele marcate cu fluorescență sunt adăugate la un fragment ADN special prin PCR. Pentru alungirea catenei ADN se utilizează deoxynucleotide regulate (dNTPs). Cu toate acestea, ddNTP-urile sunt adăugate la amestecul de reacție, care este marcat cu fluorescență. Din moment ce ddNTPs nu au o grupă 3 'OH în molecula de zaharoză deoxiriboză, nu poate să apară o creștere a lanțului, terminând creșterea lanțului. Gama principală de fosfat de zahar a ADN-ului este formată prin formarea de legături fosfodiestere între grupul 3 'OH din grupul zaharoză deoxiriboză și grupul fosfat al nucleotidelor care intră. Cu toate acestea, ddNTP-urile sunt adăugate în concentrații scăzute; prin urmare, acestea nu inceteaza in acelasi timp cresterea lantului.
Se adaugă patru tipuri de ddNTP la patru amestecuri PCR separate. Se efectuează patru reacții PCR separate prin adăugarea ddATP, ddGTP, ddCTP și ddTTP. Prin urmare, în fiecare amestec de reacție, creșterea lanțului este terminată la nucleotidele A, G, C și, respectiv, T. Ca exemplu, în amestecul de reacție cu adăugat ddATP, creșterea diferitelor ampliconi este terminată la fiecare nucleotidă A din fragmentul ADN. Determinarea secvenței ADN prin secvențierea lui Sanger este prezentată în figura 2.
Figura 2: Sequencingul Sanger
Fiecare dintre cele patru tipuri de nucleotide sunt marcate prin culoare fluorescentă separată; ddATP este marcat cu colorant verde; ddGTP este marcat cu colorant galben; ddCTP este marcat cu albastru; ddTTP este marcat cu colorant roșu. Prin urmare, amplicoanele celor patru reacții PCR sunt etichetate în culori separate.
După amplificarea fragmentului ADN interesat, amplicoanele sunt separate fie prin electroforeză în gel, fie prin electroforeză capilară. Secvența nucleotidică a fragmentului ADN poate fi determinată prin detectarea fluorescenței emițătoare. Secvența nucleotidică de 750-1000 perechi de perechi lungi de fragmente lungi poate fi determinată cu ușurință pentru fiecare rulare prin secvențierea lui Sanger. Totuși, determinarea secvenței nucleotidice a unui genom întreg rămâne contestabilă datorită unui număr mare de nucleotide din genomi. Cu toate acestea, tehnicile de secventiere de ultima generatie, cum ar fi 454 secventiere, aproximativ 20 de milioane de perechi de baze pot fi citite pe o singura etapa.
Concluzie
Secvențierea ADN este o tehnică de biologie moleculară utilizată pentru determinarea secvenței de nucleotide a fragmentelor ADN. În timpul secvențierii, nucleotidele marcate cu fluorescență sunt adăugate la fragmentele ADN prin PCR. Prin detectarea fluorescenței care emite, secvența de nucleotide poate fi determinată.
Referinţă:
1. "Secvențierea ADN-ului". Academia Khan, Disponibil aici.
Datorită fotografiei:
1. "Secvența ADN" de Sjef - Activitate proprie, Domeniul Public) prin Wikimedia Commons
2. "Dideoxy-Methode" De Christoph Goemans (modificat) - Dr. Norman Mauder, pe baza de date Christoph Goemans (CC BY-SA 3.0) prin Wikimedia Wikimedia
