Cum funcționează Western blotting

Western blotting este o tehnică în biologia moleculară utilizată pentru detectarea unei proteine ​​specifice într-o probă. Utilizează SDS-PAGE pentru a separa proteine ​​pe baza mărimii lor și aceste proteine ​​separate sunt apoi transferate într-o membrană. Această tehnică utilizează anticorpi primari specifici în etichetarea unei anumite proteine ​​în blot. Anticorpii secundari care sunt marcați cu proteine ​​reporterice detectează proteinele labile cu anticorpul primar.

Domenii cheie acoperite

1. Ce este Western Blotting
     - Definiție, fapte, aplicații
2. Cum funcționează Western blotting
     - Procesul de Western Blotting

Termeni cheie: Dezvoltarea culorii, membrana nitrocelulozei, anticorpul primar, anticorpul secundar, Western Blotting

Ce este Western Blotting

Western blotting este o tehnică de hibridizare utilizată în detectarea unei anumite proteine ​​în cadrul unei probe. Se mai numește imunoblotting, deoarece tehnica folosește anticorpi atât pentru marcarea proteinei de interes, cât și pentru detectarea proteinelor marcate cu anticorpi.

Figura 1: Western Blot

Western blotting a fost dezvoltat pentru prima dată de către Towbin în 1979 și este utilizat în prezent ca o tehnică de rutină de analiză a proteinelor. 

Cum funcționează Western blotting

Western blotting este utilizat în principal pentru detectarea unei proteine ​​specifice într-o probă. Etapele tehnicii Western blotting sunt descrise mai jos.

1. SDS-PAGE - Proba proteică este separată pe baza dimensiunii prin SDS-PAGE.
2. Transferarea proteinelor într-o membrană - Proteinele cu dimensiuni fracționate sunt transferate fie într-o membrană de nitroceluloză, fie în difluorid de poliviniliden (PVDF). Tehnicile implicate în acest transfer sunt transferul de difuzie.
3. Blocarea site-urilor nespecifice - Locurile neocupate de pe membrană sunt blocate pentru a preveni legarea nespecifică a proteinelor. Lipsa laptelui uscat sau a albuminei serice bovine (BSA) poate fi utilizată în acest scop.
4. Incubarea anticorpului primar - Membrana blocată este incubată cu o soluție anticorp primar. Acești anticorpi primari se leagă la o anumită proteină pe membrană.
5. Incubarea anticorpului secundar - Membrana este incubată cu anticorpi secundari, care se leagă la anticorpii primari. Anticorpii secundari sunt conjugați cu proteinele reporter. Aceste proteine ​​reporter pot fi biotină, fosfatază alcalină sau peroxidază de hrean.
6. Detectarea proteinelor prin dezvoltarea culorii - Reporterii de enzime conjugate reacționează cu substratul lor pentru a genera o fosfatază alcalină colorată, transformând BCIP într-un produs de culoare albastră, în timp ce peroxidaza din hrean convertește lumenul, emite luminesc.

Figura 2: Western Blotting - Procedură

Concluzie

Western blotting este o tehnică de hibridizare utilizată în detectarea prezenței unei proteine ​​particulare într-o probă. Utilizează SDS-PAGE pentru a separa proteine ​​pe baza mărimii și legării lor cu anticorpi primari, care pot fi recunoscuți de anticorpii secundari în timpul dezvoltării culorii.

Referinţă:

1. "Principiul Fundamental Western Blotting, cum functioneaza Bloturile Western". Boster, Disponibil aici.

Datorită fotografiei:

1. "Imunoblot de acid anti-lipoic" De TimVickers - Activitate proprie (CC BY-SA 3.0) prin Wikimedia Commons
2. "Western Blotting" de Cawang - munca proprie, CC0) prin Wikimedia Commons