Cum se calculează eficiența transfecției

Eficacitatea de transfecție poate fi calculată prin numărarea numărului de celule transfectate pe celulele totale într-o anumită probă. Numărul de celule poate fi numărat prin două metode. Metoda cea mai frecvent utilizată este utilizarea reporterilor ușor tractabili. Acești reporteri pot fi proteina verde de fluorescență (GFP), luciferază, beta-galactozidază, fosfatază alcalină secretă (SEAP). Metoda cea mai recentă pentru a calcula eficiența transfecției este de a eticheta acizii nucleici, permițând monitorizarea livrării intracelulare a acestora. Unele alte abordări, cum ar fi metoda Western Blotting, imunostaining și analize funcționale pot fi, de asemenea, utilizate pentru a calcula eficiența transfecției. Deoarece eficiența transfecției depinde de mai mulți parametri experimentali, determinarea eficienței transfecției este cheia pentru determinarea influenței diferiților factori asupra transfecției.

Domenii cheie acoperite

1. Care sunt metodele utilizate pentru a calcula eficiența transfecției
     - Sisteme de reporteri
2. Cum se calculează eficiența transfecției
     - Numărarea celulelor

Termeni cheie: Cytometry Flow, GFP, etichetarea acidului nucleic, sistemul Reporter, eficiența transfecției

Care sunt metodele utilizate pentru a calcula eficiența transfecției

Sunt utilizate diferite tipuri de metode pentru a calcula eficiența transfecției.

1. Sisteme de reporteri

- Proteina de fluorescență verde (GFP) - GFP se găsește în mod natural în meduze. Se utilizează atât pentru analiza calitativă cât și pentru cea cantitativă a celulelor transfectate prin transfecția simultană a genei GFP cu gena de interes. Analiza calitativă se poate realiza sub microscop fluorescent. Analiza cantitativă se poate face prin citometrie în flux. În plus față de GFP, proteina de fluorescență roșie (RFP) și proteina de fluorescență galbenă (YFP) pot fi de asemenea utilizate ca reporteri. E coli sunt prezentate colonii care exprimă proteine ​​fluorescente figura 1.

Figura 1: Proteine ​​fluorescente

• luciferazei - Luciferaza se găsește în mod natural în licurici, generând lumină. Testele de luciferază sunt foarte sensibile și pot fi utilizate pentru analiza cantitativă a ADN-ului transfectat.
• Beta-galactozidază - Beta-galactozidaza se găsește în E coli. Se folosește în analiza calitativă efectuată cu X-gal și analiza cantitativă efectuată prin metode colorimetrice, fluorescente sau chemiluminescente.
• Fosfataza alcalină secretă (SEAP) - SEAP este un reporter stabil la căldură, care este secretat din celulele mamifere atunci când este exprimat.

2. Nucleic acid Labeling - Pentru transfecție pot fi utilizate plasmide marcate fluorescente. Apoi pot fi numărate sub un microscop fluorescent.

3. Western blotting, immunostaining și alte teste funcționale

Cum se calculează eficiența transfecției

Numărul de celule care prezintă reporterul și numărul de celule care nu prezintă reporterul pot fi numărate sub microscop sau prin citometrie în flux. Procentul de celule care prezintă reporterul dă eficiența de transfecție.

Figura 2: Eficiența transfecției

Concluzie

Eficacitatea de transfecție poate fi calculată prin determinarea numărului de celule care prezintă ADN transfectat față de numărul total de celule din probă. Numărul de celule poate fi calculat sub microscop sau prin citometrie de flux utilizând un sistem de reporter.

Referinţă:

1. "Măsurați eficiența transfecției." Mirus Bio LLC, Disponibil aici.

Datorită fotografiei:

1. "E. coli care exprimă proteine ​​fluorescente "De Erin Rod - Muncă proprie, (CC BY-SA 4.0) prin Wikimedia Commons