Cum de a proiecta grunduri pentru QPCR

PCR-ul cantitativ sau în timp real este folosit ca un test de rutină pentru monitorizarea modificărilor relative ale exprimării genelor în diferite condiții experimentale. Proiectarea primerilor și a probelor în timpul QPCR este unul dintre factorii cei mai importanți care afectează calitatea și succesul analizei. Pentru proiectarea primerilor pentru QPCR se aplică mai multe linii directoare: conținutul de GC al primerilor trebuie să fie de 35-65%; temperatura de topire a primerilor trebuie să fie cuprinsă între 60 și 68 ° C; ar trebui să evităm și structurile secundare, repetițiile de Gs sau Cs care sunt mai lungi de 3 baze și formarea dimerilor de primer.

Domenii cheie acoperite

1. Ce este QPCR
      - Definiție, proces, utilizări
2. Cum de a proiecta grunduri pentru QPCR
     - Linii directoare pentru designul de bază pentru QPCR

Termeni cheie: Coloranți fluorescenți, Conținut GC, Temperatura de topire, Grunduri, PCR cantitativ (QPCR)

Ce este QPCR

QPCR este un tip de PCR care permite cuantificarea produsului în timp real. Culorile fluorescente pot fi utilizate în cuantificarea produselor PCR prin etichetarea lor în fiecare etapă. Două metode de etichetare fluorescentă pot fi utilizate în testele QPCR. Acestea sunt utilizarea coloranților fluorescenți și a probelor marcate fluorescente. Fluorescentele colorante se leagă de produsul PCR, în timp ce probele se ancorează cu produsul PCR pentru a forma un ADN triplex stabil. Colorantul fluorescent utilizat pe scară largă în QPCCR este SYBR Green, în timp ce sondele pot fi Taqman. Utilizarea probelor în detectarea produselor PCR în timpul QPCR oferă rezultate mai precise și crește sensibilitatea analizei.

Figura 1: Mecanismul QPCR

Cum de a proiecta grunduri pentru QPCR

Proiectarea primerilor pentru QPCR este crucială pentru creșterea fiabilității, preciziei și sensibilității analizei. Ghidurile pentru proiectarea primerilor QPCR sunt descrise mai jos.

1. Produs PCR / mărime Amplicon - Dimensiunea produsului PCR ar trebui să aibă dimensiunea de 50-210 de perechi de baze.
2. Dimensiunea primerului - Lungimea primerilor trebuie să fie de 19-23 nucleotide.
3. Conținutul GC - conținutul de GC al primerilor ar trebui să fie de 35-65%.
4. Temperatura de topire (Tm) - Temperatura de topire a primerilor trebuie să fie de 60-68 ° C. Temperatura de recoacere pentru analiză este de 5 ° C mai mică decât Tm a primerilor.
5. Legătura exon-exon - Atunci când se amplifică ADNc prin QPCR, primerii trebuie să cuprindă legătura exon-exon pentru a evita amplificarea ADN-ului contaminant.
6. Repetări și alergări - Repetarea dinucleotidelor (TCTCTCTCTC) și nucleotidele repetate (de exemplu, TAAAAAAAGC) trebuie evitate.
7. 3 "Complementaritate - Regiunile complementare ale capetelor 3 'ale primeriilor inversi și inversi ar trebui evitate pentru a preveni formarea dimerilor primerului.
8. 3 'Stabilitatea - Resturile G sau C trebuie incluse la capătul 3' al primerului pentru a crește stabilitatea recoacerii.
9. Clemă GC - una sau două cleme GC de la capătul 5 'al grundului mărește specificitatea recoacerii.
10. Specificitate - Specificitatea primerilor trebuie verificată de BLAST
11. SNP - Primerii nu ar trebui să conțină variații SNP (polimorfism unic nucleotid) cunoscute

Mai multe instrumente online pot fi utilizate în proiectarea grundului în QPCR cum ar fi Primer3, Primer-BLAST, IDT PrimerQuest, Primer Bank și OAT.

Figura 2: Formarea primerilor-dimeri

Primerii trebuie să fie proiectați astfel încât să se evite formarea de dimeri de primer în QPCR. Este critică atunci când se utilizează coloranți fluorescenți pentru detectarea produsului PCR, deoarece acești coloranți se leagă de dimeri de primer pentru a da rezultate fals pozitive.

Concluzie

QPCR este utilizat pentru detectarea și cuantificarea produselor PCR. Proiectarea primerelor este esențială în QPCR pentru a spori acuratețea rezultatelor. Astfel, este important să urmați cu atenție orientările în proiectarea primerilor pentru QPCR.

Referinţă:

1. "Proiectarea și optimizarea testului QPCR" Bio-Rad, disponibil aici.

Datorită fotografiei:

 

1. "Taqman" De Utilizator: Braindamaged - Muncă proprie a Uploaderului inițial (Domeniul Public) prin Wikimedia Commons
2. "Formarea dimei de bază" En "De Tzachi Bar - Activitate proprie (CC BY-SA 3.0) prin Wikimedia Commons