Cum de a proiecta grunduri pentru site-ul mutagenesisului directionat

Mutageneza direcționată pe site (SDM) este o in vitro metoda de creare a unei mutații într-o secvență cunoscută. Acesta este adesea efectuat prin metode bazate pe PCR. În mod tipic, una sau două baze sunt modificate în mutageneză direcționată pe situs. Primerii pot fi proiectați cu mutațiile dorite pentru a introduce mici modificări la secvența de nucleotide. Extensia de primer și inversarea PCR pot fi folosite pentru a introduce mutații pe scară largă. Această abordare poate schimba compoziția de aminoacizi a unei proteine ​​particulare. Mutageneza direcționată pe situs este utilizată pentru a studia modificările activității proteinelor. Este, de asemenea, folosit pentru a crea proteine ​​de fuziune, de asemenea.

Domenii cheie acoperite

1. Ce este mutageneza direcționată pe sit (SDM)
      - Definiție, rol, metodă
2. Cum de a proiecta grunduri pentru site-direcționate Mutagenesis
     - Substituiri, ștergeri, inserții

Termeni cheie: deleții, inserții, mutații, mutageneză direcționată pe situs, substituții, PCR tradițional

Ce este mutageneza direcționată pe sit

Mutageneza direcționată pe situs este o tehnică de biologie moleculară utilizată pentru a introduce modificări specifice unei secvențe nucleotidice a unei gene. Se utilizează pentru a schimba secvența de aminoacizi a unei proteine, a introduce sau a elimina site-urile de restricție, a distruge locurile de legare a transcripției și a crea proteine ​​de fuziune.

Proces

În timpul mutagenezei direcționate către situs, mutațiile sunt introduse la plasmide folosind primeri, constând din mutația dorită. Întregul șablon este amplificat prin PCR, încorporând mutația în șablon. Apoi, șablonul părinte este îndepărtat din proba cu utilizarea unei enzime endonucleaze dependente de metilare. Produsul PCR sau molecula de plasmidă pătrată cu mutația dorită este transformată în bacterii. Plasmidele pot fi izolate de bacterii cu modificările dorite. Procesul de mutageneză direcționată în sit este arătat în figura 1.

Figura 1: Mutageneza direcționată pe situs

Se folosesc trei tipuri principale de metode pentru introducerea mutațiilor dorite în mutageneza direcționată pe situs. Ele sunt PCR tradiționale, extensie de primer și PCR invers. Extensia primerilor și PCR inversă pot fi folosite pentru a introduce modificări nucleotidice pe scară largă.

PCR tradițional

PCR tradițional poate fi utilizat pentru a introduce una sau două modificări de nucleotide la secvența țintă cu primeri modificați. Modificările pot fi substituții, deleții sau adăugiri de nucleotide. Mutația este încorporată în amplicon în timpul PCR. Prin urmare, secvența inițială este înlocuită de secvența mutantă din primer.

Primer Extension

În extensia primerului, mutația dorită este încorporată în timpul unei PCR nestemate. Aici, secvența țintă este flancată de doi primeri. Mutația dorită este încorporată în primerul intern și mutația este introdusă în a doua rundă PCR. În general, specificitatea unei reacții PCR scade cu numărul crescut de nucleotide neadecvate în primeri. Cu toate acestea, primerii interni lungi cu mutații la scară largă pot fi utilizați în extensia primerului, deoarece PCR imbricat poate crește specificitatea reacției PCR.

PCR invers

PCR inversat este o metodă de amplificare a fragmentelor ADN necunoscute prin proiectarea primerilor într-o secvență de ADN cunoscută. Acesta poate fi utilizat pentru a înlocui, șterge sau introduce nucleotide la scară largă.

Aplicațiile de mutageneză direcționată pe situs sunt descrise mai jos.

1. Pentru a studia structura, funcția și proprietățile catalitice ale proteinelor
2. Pentru a îmbunătăți proprietățile proteinelor (ingineria proteinelor)
3. Pentru introducerea sau îndepărtarea situsurilor endonucleazice de restricție.

Cum de a proiecta grunduri pentru site-direcționate Mutagenesis

Mutageneza direcționată pe site este un proces de introducere a mutației dorite cu ajutorul unui primer. Mutația poate fi o substituție, inserție sau ștergere. Deoarece specificitatea PCR scade cu nucleotidele nesatisfăcătoare crescute în primer, PCR tradițional poate introduce numai una sau două schimbări de perechi de baze la secvența țintă. Alte metode, cum ar fi extensia de primer și PCR invers, pot fi folosite pentru a introduce mutații pe scară largă. Proiectarea primerului în mutageneza direcționată pe sit este prezentată în figura 2.

Figura 2: Primerii pentru mutageneza direcționată pe situs

Substituţie

Pentru substituții, unul dintre primii doi ar trebui să conțină mutația dorită în mijlocul primerului. Aici, site-ul care conține mutația nu se recuperează la secvența țintă deoarece face o denaturare.

ștergere

Pentru ștergeri, secvența care urmează să fie eliminată din țintă poate fi neglijată în timpul proiectării primerului. Deoarece această secvență este situată în afară de regiunea flancată prin primeri, nu ar fi amplificată în timpul PCR.

inserare

Pentru inserții, secvența care urmează să fie adăugată este cuplată la capătul 5 'al unuia dintre primeri în timpul proiectării primerului. Prin urmare, secvența inserată poate rămâne atașată la amplicon, de asemenea.

Concluzie

Mutageneza direcționată pe situs este o tehnică utilizată pentru introducerea mutațiilor într-o secvență ADN. Aceste mutații pot fi substituții, inserții sau ștergeri. Mutațiile la scară mică pot fi introduse în PCR tradițional. Mutațiile pe scară largă pot fi introduse în extensia primerului sau PCR invers. Introducerea mutației se face prin încorporarea mutației dorite în primer. 

Referinţă:

1. "Metode pentru mutageneza direcționată în sit". Tehnologii ADN INTEGRATE, Disponibil aici.

Datorită fotografiei:

1. "Site-ul mutagenesis directionat" de catre Knbusby - Munca proprie (Public Domain) prin Wikimedia Commons