Cum se fac grunduri pentru PCR

Primerii sunt o componentă esențială în amplificarea ADN-ului atât in vivo și in vitro. In vivo, enzima, ADN polimeraza necesită un primer pentru inițierea replicării ADN. In vitro, primii sunt folosiți în cea mai mare parte pentru inițierea reacției în lanț a polimerazei (PCR). Unele alte tehnici, inclusiv secvențierea, clonarea, mutageneza direcționată pe sit, etc. necesită primeri. Prin urmare, proiectarea de primeri pentru in vitro tehnicile devin destul de simple, dar un proces provocator pentru biologi moleculari. Prin urmare, regulile de bază pentru proiectarea primerului atât pentru PCR, cât și pentru secvențiere sunt discutate în acest articol.

Domenii cheie acoperite

1. Ce este un Primer
     - Definiție, tipuri, rol
2. Cum funcționează grundurile într-o PCR
     - Caracteristicile ADN-ului, Procesul de PCR
3. Cum se fac grunduri pentru PCR
     - Reguli de bază pentru proiectarea primerilor PCR
4. Cum de a proiecta un primer de secventiere
    - Caracteristicile grundurilor de secvențiere

Termeni-cheie: sinteza ADN-ului, grunduri de avans, lungime, temperatura de topire, PCR, grunduri inversoare, grunduri de secventiere

Ce este un Primer

Un primer este o catenă scurtă de ADN sau ARN care servește ca punct de plecare pentru sinteza ADN. Enzimele care catalizează replicarea ADN sunt capabile de adăugarea de nucleotide la un capăt 3 'existent. Prin urmare, primerul pune bazele pentru sinteza ADN-ului servind ca un prim. ARN primeri sunt utilizate în interiorul celulei pentru inițierea replicării ADN-ului prin ADN polimerază. Cu toate acestea, sintetic Primeri de ADN pot fi utilizate pentru amplificarea ADN-ului, în principal prin PCR și alte tehnici. Două tipuri de primeri sunt utilizate în PCR, și sunt cunoscute ca primeri invers și invers. În timpul PCR, milioane de copii ale fragmentului ADN dorit pot fi produse prin flancul acelei secvențe ADN particulare în ADN-ul genomic prin primeri invers și invers. Împreună cu primerul invers și care inversează o anumită secvență de ADN sunt prezentate în figura 1.

Figura 1: Grunduire înainte și înapoi

Cum funcționează primerii în PCR

ADN-ul este o moleculă care are două fire care sunt ținute împreună. Modelul pereche de bază este complementar fiecăruia în ambele toroane. Cele două fire sunt ținute împreună de legăturile de hidrogen dintre bazele de azot complementare. În plus, fiecare componentă are propria direcționalitate. O catenă are direcția de la 5 'la 3', în timp ce cealaltă are direcția de la 3 'la 5'. Prin urmare, cele două fire sunt antiparalerale. Lanțul cu direcția 5 'până la 3' este cunoscut ca firul de sens, în timp ce firul cu direcția 3 'până la 5' este cunoscut ca firul antisens. Fiecare două toroane ar trebui să fie sintetizate individual în timpul PCR.

Cele trei etape ale PCR sunt denaturarea, recoacerea și alungirea. În denaturare, cele două fire de ADN sunt separate prin ruperea legăturilor de hidrogen prin încălzirea la 95 ° C. Introducerea primerului se leagă de firul sens, în timp ce primerul invers se leagă de firul antisens. Reacția primerilor are loc când temperatura scade de la 95 ° C la 50-60 ° C. Prin urmare, ambele toroane pot fi sintetizate în același timp cu ajutorul lui Taq polimerază. Amplificarea ambelor sensuri și a firelor antisens apar în direcția 5 'la 3'. Deoarece PCR este o reacție exponențială, cele trei etape sunt repetate în 25-35 de cicluri. Atât primii, cât și inversorii, sunt utilizați în fiecare ciclu pentru a produce aproximativ 2³⁵ copii ale fragmentului dorit de ADN. Rolul primeriilor în PCR este prezentat în figura 2.

Figura 2: PCR

Cum se fac grunduri pentru PCR

Pentru a amplifica un fragment de ADN particular în genom, acel fragment ADN special trebuie să fie flancat de ambii primeri inversi și inversi. Prin urmare, ambii primeri ar trebui să fie complementari secvențelor care flanchează fragmentul ADN. Orientările de bază pentru proiectarea cu succes a primerilor PCR sunt descrise mai jos.

1. Direcția amortizorului înainte și înapoi trebuie să fie de 5 'până la 3'.
2. Lungimea fiecărui primer trebuie să aibă între 18 și 25 nucleotide în lungime.
3. Conținutul de GC al primerilor este între 40 și 60%, iar prezența unui C sau G în capătul 3 'al primerului poate promova legarea.
4. Temperatura de topire și temperatura Tm (temperatura la care jumătate din grund au răcit la șablon) din perechea de grunduri trebuie să fie similare și peste 60 ° C. Diferența maximă ar trebui să fie de 5 ° C.
5. Capătul 3 'al primerului trebuie să se potrivească exact cu ADN-ul șablonului.
6. Cel puțin 2G sau C baze (clemă GC) trebuie să fie prezente în ultimele 5 baze la capătul 3 'al primerului. Clema GC promovează o legare puternică la secvența țintă.
7. Restricții cu 5-6 nucleotide pot fi adăugate la capătul 5 'al primerului.
8. Repetarea dinucleotidelor (ATATATAT) sau repetarea aceleiași nucleotide de mai mult de 4 ori (ACCCC) trebuie evitată în secvențele de primer. Acest lucru cauzează erori.
9. Trebuie evitată omologia intra-primer sau structurile secundare ale primerilor. Omologia inter-primer sau secvențele complementare în primeri și inversi ar trebui să fie evitate. Ambele condiții pot forma autodimeri sau dimeri de primer.
10. Valoarea ΔG pentru analiza dimerului trebuie să fie între 0 până la -9 kcal / mol.

Multe instrumente online sunt disponibile pentru ușurința proiectării grundului, cum ar fi Primer 3, Primer X, NetPrimer, ADNstrar etc. Specificitatea primerilor proiectați poate fi determinată de unelte cum ar fi NCBI Primer-BLAST sau UCSC in-silico PCR. 

Figura 3: Interfața Primer 3

Cum de a proiecta un primer de secventiere

Analizoarele secvențiale sunt scurte, fire ADN, la fel ca primerii PCR. Cu toate acestea, primerii PCR sunt concepuți pentru amplificarea unui fragment ADN special, în timp ce primerii de secvențiere sunt utilizați pentru a dezvălui secvența nucleotidică a fragmentului ADN amplificat prin PCR. Spre deosebire de primerii PCR, un singur primer poate fi utilizat în secvențiere, dacă numai secvența țintă are o lungime mai mică de 500 bp. Ca exemplu, primerul înainte al PCR poate fi folosit în secvențiere, pentru a amplifica numai firul sens. Mai mult, gradul de inconsistență tolerat în timpul reacției de secvențiere este mai mare decât PCR. În general, primerii PCR sunt complementari la secvența țintă. Cu toate acestea, unii primeri de secvențiere nu au legătură cu secvența țintă. Ele sunt cunoscute ca grunduri universale. Primerele universale, cum ar fi T7 sau SP6, se reconectează la vectorul care poartă secvența țintă. Acestea pot fi utilizate atât pentru o varietate de vectori, cât și pentru diferite tipuri de fragmente de ADN.

Concluzie

Primerii sunt utilizați în PCR și secvențiere pentru inițierea sintezei ADN. Două tipuri de primeri PCR pot fi identificați drept grăsime înainte și inversă. Amortizoarele înainte se asimilează cu lanțul sens, în timp ce primerii inversi se recuperează la firul antisens. În secvențiere, fie amortizorul înainte sau invers poate fi utilizat pentru a amplifica ținta. În timpul proiectării primerilor, ar trebui luați în considerare mai mulți factori, cum ar fi lungimea grundului, Tm și conținutul de GC. Multe instrumente online sunt disponibile care pot fi utilizate pentru proiectarea primerilor pentru o anumită secvență.

Referinţă:

1. "Primer Design: Sfaturi pentru un proces eficient". Genome Compiler Corporation, 3 noiembrie 2015, disponibil aici.
2. "Grunduri de secventiere si design de grunduri". Amestecare de grunduri si design de grund, Universitatea din Calgary, Disponibil aici.

Datorită fotografiei:

1. "Primer RevComp" de Zephyris - Activitate proprie (CC BY-SA 3.0) prin Wikimedia Commons
2. "Reacția în lanț a polimerazei" Prin Enzoklop - Activitate proprie (CC BY-SA 3.0) prin Wikimedia Commons