Cum se face o linie celulară transfecată stabilă

Transfecția stabilă este introducerea pe termen lung a ADN străin în celule. Celulele transfectate stabil trec ADN străin prin descendenți. Prin urmare, pentru a face liniile de celule transfectate stabil, ADN străin trebuie să fie integrat în genomul liniei celulare. Cu toate acestea, moștenirea stabilă poate fi observată și în ADN nongenomic. O transfecție reușită, stabilă necesită metode eficiente de administrare a ADN-ului, precum și metode de selecție pentru ADN străin în linia celulară. Linile celulare transfectate stabil sunt utilizate pentru o gamă largă de aplicații, cum ar fi producția de proteine ​​recombinante, studii de funcție a genei, teste de descoperire a medicamentelor etc..

Domenii cheie acoperite

1. Cum se face o linie celulară transfecată stabilă
      - Protocol de generare a liniei celulare stabile
2. Cum se selectează ADN-ul transfectat în linia celulară
     - Selectarea liniei celulare transfectate stabil

Termeni cheie: Întreținerea epizomală, integrarea în genom, plasmida, selecția, liniile celulare transfectate în mod stabil

Cum se face o linie celulară transfecată stabilă

Transfecția este o metodă de transfer al genei în care materialul genetic este introdus în mod deliberat în celula gazdă prin metode chimice sau nechimice. Există două tipuri de linii celulare transfectate stabil:

1. Principalul tip de linii celulare stabile este generat de integrarea directă a ADN transfectat în genomul organismului gazdă. ADN-ul transfectat este integrat în genom prin recombinare omoloagă.
2. Cealaltă metodă de a genera linii celulare stabile este menținerea epizomală a ADN-ului transfectat. Vectorii eucariotici sunt utilizați în transfecția ADN care nu este integrată în genom. Cu toate acestea, stabilitatea ADN-ului epizomal este scăzută. De asemenea, epizomele sunt menținute numai de anumite tipuri de specii. Linia celulară transfectată stabil este prezentată în figura 1.

Figura 1: Linii celulare transfectate stabil

Proces

Etapele implicate în generarea de linii celulare stabile sunt descrise mai jos.

1. Generarea unei curbe de ucidere determinând concentrația optimă de selecție a antibioticelor - Celulele sunt supuse unor cantități crescătoare de concentrație de antibiotice pentru a determina concentrația minimă de antibiotice necesară pentru a ucide toate celulele timp de o săptămână.
2. Transfecția celulelor cu structura plasmidică dorită - Metoda de transfecție diferă de tipul celulelor gazdă. Reactivii cu lipozomi sunt utilizați în transfecția liniilor celulare aderente. Metodele electrotransfecție sau virale sunt utilizate pentru a transfecta liniile de celule de suspensie.
3. Selectați și extindeți coloniile policlonale stabile - La 48-72 ore de transfecție, la culturi se adaugă concentrații ridicate, optime și scăzute de antibiotice selective pentru a obține liniile celulare transfectate stabil.

Cum se selectează ADN transfectat în liniile celulare

Markerii de selecție sunt co-exprimați cu ADN-ul transfectat pentru selectarea celulelor cu succes transfectate. Gena marker ar putea fi în același vector (cis) utilizat pentru transfecția celulei gazdă sau pe un alt vector (trans). Rezistența la antibiotice cum ar fi neomicina, zeocina, higromicina, puromicina, DHFR, etc. poate fi utilizată în selecție. În plus, genele transfectate pot fi etichetate cu GFP.

Concluzie

Linile celulare stabile pot fi realizate în principal prin integrarea ADN-ului transfectat în genom. Mai mult, menținerea epizomală a ADN-ului transfectat poate fi, de asemenea, utilizată pentru a face liniile celulare stabile pentru o perioadă lungă de timp în unele organisme gazdă. Trebuie să existe o metodă de selecție pentru identificarea ADN-ului transfectat în linia celulară. 

Referinţă:

1. "Protocolul de generare a liniilor celulare stabile". Creative BioMart, Disponibil aici.

Datorită fotografiei:

1. "Producția de șoareci knockout 2" de Kjaergaard - Muncă proprie (CC BY 3.0) prin Wikimedia Commons