Diferența dintre PCR și RT PCR

Principala diferență - PCR față de RT-PCR

PCR și RT-PCR sunt două tehnici importante în biologia moleculară. PCR a fost dezvoltat de Kary Mullis în anii 1980. Este capabil să mărească numărul de copii ale unei anumite gene într-o manieră exponențială, facilitând detectarea acelui fragment ADN special. Taq Polimeraza este enzima cea mai frecvent utilizată în sistemele PCR. Este o enzimă termostabilă. În RT-PCR, transcripția inversă este urmată de PCR. Enzima, revers transcriptaza este implicată în sinteza ADN-ului complementar de la ARN. principala diferență între PCR și RT-PCR este asta PCR utilizează ADN-ul dublu catenar ca șablon, în timp ce RT-PCR utilizează ARN ca șablon.

Domenii cheie acoperite

1. Ce este PCR
      - Definiție, proces, aplicație
2. Ce este RT PCR
      - Definiție, Caracteristici, Aplicație
3. Care este diferența dintre PCR și RT PCR
      - Compararea diferențelor cheie

Termeni-cheie: PCR, RT-PCR, Reacția lanțului de polimerază, reacția lanțului de polimerază transcriere inversă, template-ul ADN, polimeraza ADN, denaturarea, recoacerea, extinderea grundului

Ce este PCR

PCR (Reacția lanțului de polimerază) este o metodă relativ simplă, dar revoluționară. PCR utilizează capacitatea enzimei, ADN polimeraza de a sintetiza noi fire de ADN într-o manieră complementară față de șirul de șablon oferit. PCR este o tehnică indispensabilă folosită atât în laboratoarele clinice, cât și în laboratoarele de cercetare pentru analiza funcțională a genelor, diagnosticarea și monitorizarea bolilor ereditare, donarea ADN-ului, secvențierea și amplificarea antică a ADN-ului. Șablonul ADN, nucleotidele, primerii și ADN polimeraza sunt cele patru componente majore ale PCR. Șablon ADN este de obicei un ADN dublu catenar cu secvența țintă, care urmează să fie amplificată. Taq ADN polimeraza care este izolat de Thermus aquatics este frecvent utilizat în PCR. pfu ADN polimeraza este un alt tip de polimerază ADN cu fidelitate ridicată. Ambii Taq și pfu polimerazele sunt rezistente la căldură. Nucleotidele adăugate de ADN-polimerazele sunt adenină (A), guanină (G), citozină (C) și timină (T). Deoarece ADN polimeraza poate adăuga doar o nouă nucleotidă într-un capăt 3 'al unei catene ADN preexistente, este necesar un primer oligonucleotid pentru inițierea sintezei ADN. Cerința unui primer în PCR permite delimitarea doar a unei regiuni specifice în șablon. Secvența țintă este flancată de primeri și inversi. La sfârșitul unei PCR, noi copii numite amplicoane ale unei secvențe specifice de ADN sunt acumulate în miliarde. Componentele PCR trebuie optimizate astfel încât să îmbunătățească performanța PCR, minimizând eșecul.

PCR este un proces automatizat realizat de cicluri termice, care pot comuta între diferite temperaturi. PCR este un proces în trei etape.

denaturarea - Șablonul de ADN dublu catenar este separat în două toroane unice prin încălzire la 94-95 ° C.
Recoacerea - Primerii înainte și invers se leagă de secvențele complementare din șablon. Temperatura acestei etape depinde de temperatura de topire a combinației de grunduri.
Extensie de bază - Enzima ADN polimerază extinde fiecare dintre primeri la capătul 3 'prin adăugarea de baze complementare la catena de creștere. Temperatura optimă de Taq polimerază, 72 ° C este utilizată ca temperatura în etapa de extensie. Timpul de prelungire depinde de numărul de perechi de baze din șirul de șablon.

Cele trei etape se repetă de 28-35 de ori.

Figura 1: Reacția lanțului de polimerază

Produsele PCR sunt fracționate în mărime prin electroforeză pe gel de agaroză în comparație cu o scară ADN. Vizualizarea ADN-ului pe un gel de agaroză se face prin colorare cu bromură de etidiu și observare sub UV. Benzile de ADN amplificate sub UV într-un gel colorat cu bromură de etîdiu sunt prezentate în secțiunea figura 2. Scara ADN este arătată în fanta cea mai din stânga.

Figura 2: benzi ADN

Ce este RT-PCR

RT-PCR (Reacția în lanț a reacției de revers transcriere-polimerază) este una dintre cele mai sensibile tehnici utilizate pentru detectarea ARNm. ARN este modelul adecvat pentru colectarea de informații fie despre expresia genei unui țesut normal, fie despre expresia genică a unui țesut infectat. Șablonul pentru RT-PCR poate fi fie ARN total, fie ARN viral sau bacterian respectiv. ARN este transcris invers în ADN complementar (cADN) prin enzima, revers transcriptază. Temperatura optimă a transcriptazei reversibile este de 46 ° C. ADNc este utilizat în PCR pentru obținerea produsului. Etapele din PCR cu transcripție inversă sunt prezentate în figura 3.

Figura 3: RT-PCR

RT-PCR poate fi efectuată într-o reacție în două etape sau într-o etapă. În reacția în două etape, transcripția inversă și PCR se efectuează în două etape separate. Într-o RT-PCR într-o singură etapă, transcripția inversă este urmată de PCR într-un singur tub într-o manieră secvențială. Atât cADN, cât și produsul final PCR pot fi executate pe un gel de agaroză pentru scopurile de fracționare în mărime și vizualizare. În RT-PCR cu două etape și în două etape sunt prezentate în figura 4.

Figura 4: RT-PCR cu un pas și cu două etape

Diferența dintre PCR și RT-PCR

Definiție

PCR: PCR este o tehnică utilizată în biologia moleculară pentru a amplifica un segment de ADN care generează milioane de copii ale unei secvențe ADN.

RT-PCR: RT-PCR este o variantă a PCR utilizată în detectarea expresiei genelor în biologia moleculară.

paşi

PCR: Denaturarea, recoacerea și extensia sunt cele trei etape ale PCR.

RT-PCR: În RT-PCR, transcripția inversă este urmată de PCR.

Format

PCR: O moleculă de ADN dublu catenar servește ca șablon pentru PCR.

RT-PCR: O moleculă de ARN cu o singură catenă servește drept șablon pentru transcripția inversă. O moleculă de ADN cu un singur fir servește drept șablon pentru PCR.

Enzime utilizate

PCR: ADN polimeraza este utilizată ca enzima în PCR.

RT-PCR: Reverse transcriptaza și ADN polimeraza sunt utilizate ca enzime în RT-PCR.

Primerii

PCR: Împreună și inversă sunt utilizați în PCR.

RT-PCR: Numai primerul invers este folosit pentru transcripția inversă și primii și inversorii primeri sunt utilizați în PCR.

Sensibilitate

PCR: PCR este o metodă sensibilă.

RT-PCR: RT-PCR este mai sensibil decât PCR.

Aplicații

PCR: PCR este folosit în analiza funcțională a genelor, diagnosticarea și monitorizarea bolilor ereditare, clonarea ADN-ului, secvențarea ADN-ului și amplificarea antică a ADN-ului.

RT-PCR: RT-PCR este utilizat pentru detectarea expresiei genei.

Concluzie

PCR și RT-PCR sunt două tehnici importante utilizate în biologia moleculară. Atât PCR, cât și RT-PCR sunt tehnici automatizate capabile să mărească exponențial numărul de copii ale unei secvențe ADN țintă, care este definită de primeri invers și invers. În PCR, ADN-ul dublu catenar este folosit ca șablon. Prin PCR, se poate face clonarea ADN-ului, secvențierea ADN-ului și analiza funcțională a genelor. În RT-PCR, exprimarea genei într-un țesut particular poate fi observată prin amplificarea ARN. Diferența principală dintre PCR și RT-PCR este în template-urile lor utilizate în fiecare reacție și aplicațiile lor.

Referinţă:

1. "Reacția lanțului de polimerază (PCR)". Centrul Național de Informare Biotehnologică. Biblioteca Națională de Medicină din S.U.A., n.d. Web. Disponibil aici. 01 iunie 2017.
2. "Reacția lanțului de polimerază (sau PCR)". Clonarea și analiza moleculară a genelor. N.p., n.d. Web. Disponibil aici. 01 iunie 2017.
3. Biolabs, New England. "Synthesis CDNA și RT-PCR". Sinteza CDNA și RT-PCR NEB. N.p., n.d. Web. Disponibil aici. 01 iunie 2017.

Datorită fotografiei:

1. "Reacția în lanț a polimerazei" Prin Enzoklop - Activitate proprie (CC BY-SA 3.0) prin Wikimedia Commons
2. "DNA fragmendid etiidiumbromiidiga värvitud agaroosgeelis." De Rainis Venta - Activitate proprie (CC BY-SA 3.0) prin Wikimedia Commons
3. "Reacția în lanț a polimerazei revers transversale" de Jpark623 - Lucrări proprii (CC BY-SA 3.0) prin Wikimedia Commons
4. "RT-PCR în două etape în două etape" De Jpark623 - Muncă proprie (CC BY-SA 3.0) prin Wikimedia Commons

Ştiinţă